A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Создание и генетическое манипулирование органоидами мышиных гепатоцитов
Chapters
Summary February 12th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Из мышиных гепатоцитов была создана долгосрочная система 3D органоидных культур ex vitro . Эти органоиды могут быть пройдены и генетически обработаны лентивирусной инфекцией шРНК/эктопической конструкции, трансфекцией siRNA и инженерией CRISPR-Cas9.
Transcript
Печень является самым большим органом у млекопитающих. Он играет очень важную роль в метаболизме и детоксикации. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации in vitro, это все еще очень большая проблема в долгосрочной перспективе для культивирования гепатоцитов in-vitro.
Здесь мы устанавливаем органоиды гепатоцитов из зрелых гепатоцитов. Сохраняет основные черты гепатоцитов в морфологии и функции. В этом видео мы подробно представим, как культивировать и проходить эти органоиды и как выполнять генетическую модификацию этих органоидов.
Во-первых, перфузия печени и пищеварение. Подготовьте все регионы и инструменты и сделайте их стерильными. Вымойте мышь и вскройте эпидермис и кожу, а затем попробуйте найти мешочек печи печени.
Введите в него иглы, а затем захватите это. Делают перфузию со скоростью пять миллилитров в минуту, пока печень не станет бледной. Поменяйте их в буфер перфузии, аккуратно разместите, следите за печенью, пока она не станет мягкой.
Обычно это занимает от трех до пяти минут, затем вырежьте печень и положите их в тарелки, и разрежьте их небольшими кусочками ножницами. Часто поднимайте его вверх и вниз. Обычно требуется от 10 до 15 минут, чтобы превратить их в одну клетку.
А затем поднимите его вверх и вниз в течение 10-15 минут и подайте их через слесаря. Превратите их в отдельные клетки. Соберите все ячейки в трубку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте их со скоростью, а затем соберите все пластины.
Старайтесь держать их всегда в холодном льду. Сделайте одноклеточные суспензии и посчитайте их с помощью счетчика клеток. Обычно гепатоциты если и счастливы, то обладают живым флуоресцентным.
Во вторую часть мы пытаемся усадить клетки и сделать органоидную культуру. Мы собираем все клетки суспензии, и подсчитываем клетки с определенным консентро-слиянием, а затем смешиваем их. Метрогели. и носитель кода.
Обычно мы берем, со средой и метрогелями, в соотношении 1 к 2 или 1 к 3. После тщательного перемешивания мы сажаем их на градиентные пластины. Обычно мы добавляем 100 микролитров на 24 пластинчатые колодцы.
Поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов. Через 20 минут мы ставим их обратно вперед снизу внизу, а затем на среде. Через два-три дня противодействия мы обычно видим, как органоиды выходят наружу.
Это типичный образ наших органоидов. Обычно нам нужны отдельные клетки из органоидов, если мы хотим сделать проход или сделать какой-то метод генетической модификации Мы собираем все органоиды из противоотталкивающих пластин с буфером для мытья шерсти. Бросаем супернатант, затем на пальто смываем буфер в тарелку, перемешиваем их, так что подтягиваем его вверх и вниз.
А затем мы обычно предварительно промываем все наконечники с помощью буфера стиральных лент. Чтобы избежать, все органоиды опрокидываются на кончики. А затем, с новой партией на льду или без нее, мы собираем все органоиды путем центро-синтеза.
Мы лечим их, есть обман радиентов, чтобы удалить все метрогели. После 20-30 минут инкубации на льду удаляются все метрогели. Мы собираем все чистые органоиды и добавляем трипсин, чтобы превратить их в отдельные клетки.
После добавления трипсина мы обрабатываем органоиды в инкубаторе. Требуется от 5 до 10 минут, чтобы органоиды печени стали одиночными клетками. Мы добавляем больше буферов для мытья, чтобы остановить триплатин.
А затем поднимите его вверх и вниз по направлению к ним. Для опционного процесса вы можете промыть их еще раз, чтобы удалить весь трипсин. После промывки центрофузией мы можем пересчитать их под счетчиком клеток.
Затем мы покажем, как делать транзакцию или трансфекцию этих органоидов гепатоцитов. Сначала пометьте трубки того, что вы будете делать, а затем мы сделаем трансфекцию зрения в соответствии с инструкциями производителя. Вам нужно, регент липоил факт укрощения INI MaX.
Добавляем. контролируют и специфический ген siRNA, и инкубируют их с оптимальным, согласно инструкции производителя. А затем в соответствии с концентрацией клеток мы добавляем RAN max и тщательно перемешиваем их.
Затем мы также добавляем RAN max с оптимумом отдельно и кладем их на лед. Через 5 минут мы получаем отдельную смесь RAN max с различными siRNAs, специфический ген RANi и II контролируют отдельно и тщательно их перемешиваем. Снова положите их на лед, а затем мы соберем все органоиды, замедлим центрофузию, бросим весь супернатант, добавляем РНКи макс, смесь siRNA в эту клеточную пластину и тщательно усиливаем ее вверх и вниз.
Вкратце, клетки и метка RNAi max и смесь siRNA гентрификации и инкубации в течение 4-5 часов при 37 градусах. Заключительная часть, эти органоиды гепатоцитов также могут быть инфицированы вирусом Ленти. Аналогичное сообщение было выполнено в виде трансфекции siRNA.
Контрольная и siRNA вирусные трубки были хорошо подготовлены, а оптимум был добавлен согласно инструкции производителя. Затем с заражением области похожи на поли зеленый, а затем мы добавляем другой вирус Ленти, согласно инструкции производителя конституции. Соединить одноклеточные суспензии в органоидах культуры и различные частицы в 1,5 миллилитра эппендорфских трубках, добавить, хорошо перемешать их пластинчатой этой смесью и сконцентрировать их в течение 1 часа при 32 градусах.
Слияние концентрата будет выполнено при 500 г. А после 4-5 часов инкубации при 37 градусах клеточная суспензия будет затем собрана и помещена в метрогель. И снова поместите их в инкубатор. Орган по эффективности формирования или другой функциональный анализ может быть выполнен через 7-10 дней.
Вот наши репрезентативные результаты. На рисунке 1A вы можете увидеть наш органоид гепатоцитов ALB-Cre Rosa 26-GFP или RFP от мыши. На рисунке 1B вы можете увидеть положительный сигнал Ki67 при окрашивании, который показал, что наши органоиды гепатоцитов размножаются.
На рисунках 2A и 2B показана репрезентативная экспрессия генов нашей интерферирующей экспрессии наших генов. После генетических манипуляций в органоидах гепатоцитов, интерферирующая эффективность очень эффективна. Вот рисунок 2C, вы могли видеть после генетических манипуляций с карсонитовой технологией в наших мышиных органоидах.
Вывод, наши результаты показали, что органоиды гепатоцитов могут быть расширены in vitro и генетически модифицированы. Таким образом, в этом видео мы покажем, как сделать перфузию печени и пищеварение, чтобы получить гепатоциты. Как захватывать гепатоциты и проходить через гепатоциты органоиды.
Кроме того, мы показали, как делать siRNA и векторную трансфекцию или вирусную инфекцию Ленти, чтобы сделать модификацию генетики этих органоидов. Кроме того, у нас есть два недостатка в наших органоидах. Во-первых, мы не использовали ядро или ядро меха для очистки гепатоцитов.
А во-вторых, я думаю, что следует попробовать больше факторов роста и сигнализации, чтобы улучшить время роста органоидов.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
