Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle erken kürlenme durumlarını değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Bu teknik, Leishmania fagositozunun farklı durumlarının incelenmesine ve birkaç proteinin katılımına izin veren ana avantaj olarak sunar.

Bu tekniğin, bakteriler, mayalar veya diğer hücre türleri tarafından yutulması da dahil olmak üzere diğer çalışma türlerine de genişletilebileceğini belirtmek gerekir. Bu tekniği deneyen insanlar, hücrelerin Nükleofektör çözeltisine maruz kalma süresine dikkat etmelidir. Ek olarak, transfeksiyonu en fazla iki plazmid kullanarak test etmeye başlamanızı öneririz.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Amanda Reboucas olacaktır. Başlangıç olarak, 0.2 milyon THP-1 hücresi veya insan monosit türevi makrofajları, kuyu başına 500 mikrolitre RPMI’da, 13 milimetrelik cam kapaklı 24 kuyucuklu bir plakaya tohumlayın. % 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin,% 0.9 salin ile hücreleri iki kez yıkayın ve hücreleri Tam RPMI Ortamında inkübe edin.

10 parazitteki hücrelere sabit faz Leishmania türlerini ekleyin, bir konakçı hücre oranına sahiptir ve daha sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 720 kez g’de santrifüj yapın. Hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, içselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için hücreleri% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile iki kez yıkayın. Hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede takviyeli RPMI Ortamında inkübe edin ve ardından hücreleri% 4 PFA ile 15 dakika sabitleyin.

Ardından, tercih edilen montaj ortamını kullanarak kapak fişlerini monte edin. Ardından, floresan mikroskobu altında rastgele alanlardaki en az 400 hücreyi sayın. Leishmania kaynaklı PV biyogenezini araştırmak için, 10 mililitre PMA başına 100 nanogram ve 48 saat boyunca merkaptoetanol’e 50 mikromolar ile desteklenmiş 10 mililitre Tam RPMI Medium içeren 75 santimetrekare doku kültürü şişelerinde 15 milyon THP-1 hücresini plazmidle transfekte etmeye başlayın.

Daha sonra, hücreleri% 0.9 salin çözeltisinde bir kez yıkayın ve enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi kullanarak hücreleri ayırın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez g’de santrifüj yapın. Daha sonra, THP-1 hücrelerini bir mililitre RPMI Ortamında yeniden askıya alın ve bir Neubauer odasında sayımlar yapın.

Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 kez g’de tekrar santrifüj edin ve süpernatanı atın. 100 mikrolitre Nükleofektör çözeltisinde 2 milyon hücreyi yeniden askıya alın ve bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgili protein için 0.5 mikrogram plazmid kaplama ile inkübe edin. THP-1 hücreleri ve nükleik asit içeren süspansiyonu Nükleofektör küvete aktarın.

Ardından, Nucleofector programı Y one kullanarak hücreleri transfekte edin. Transfekte edilmiş hücreleri ve tohumu, 13 milimetre cam kapaklı 24 kuyucuk plakasında 500 mikrolitre RPMI Medium’da geri kazanın. Hücreleri ve Tam RPMI Ortamını 0.5, 2, 4, 6, 12 ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

13 milimetrelik cam kapakları oda sıcaklığında bırakın ve alımdan en az 30 dakika önce ışıktan koruyun. Kapak kapaklarını emici doku ile temizleyin. Ardından, hedefe bir damla daldırma yağı ekleyin ve ardından slaytı ekleyin.

Yağ kızağa değene kadar hedefi yukarı doğru hareket ettirin. Mikroskoptaki odağı gözlemleyin ve ayarlayın ve yağ ile 63x objektif seçeneğini seçin. LIQA programını açın ve lazerleri 488, 552 ve 405 dalga boylarında ayarlayın.

Görüntü çözünürlüğünü 1024 x 1024 olarak seçin. Canlı düğmesine tıkladıktan sonra, Z-yığınını ayarlayın ve başlat seçeneğine basın. Görüntü alımını bekleyin ve ardından araçlarda maksimum projeksiyon seçeneğini seçin.

Denemeyi kaydedin ve TIFF biçimindeki görüntüleri bir bilgisayara verin. Sonuçlar, hem Leishmania Braziliensis LCL hem de Leishmania Braziliensis DL’nin makrofajlara benzer şekilde bağlandığını gösterdi. Ayrıca konakçı hücreler tarafından Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL fagositozu açısından fark gözlenmedi.

LC3’ün Leishmania Braziliensis LCL veya Leishmania Braziliensis DL tarafından indüklenen parazitoforöz vakuol veya PV’lere alınması, enfekte olmuş hücrelerde karşılaştırıldı. Dört saatlik enfeksiyondan sonra, Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL ile enfekte makrofajlarda LC3 ile süslenmiş PV’lerin benzer yüzdeleri gözlendi. Bu nedenle, sonuçlar Leishmania Braziliensis LCL ve Leishmania Braziliensis DL’nin, LC3 işe alımı ile ilgili PV’lerin bağlanması, fagositozu ve biyogenezi sırasında makrofajlarla benzer şekilde etkileşime girdiğini göstermiştir.

Temsili mikroskobik görüntüler, THP-1 hücrelerinin PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP plazmidleri ile etkili transfeksiyonunu göstermiştir. Bu protokolü deneyen insanlar sıcaklık inkübasyonuna dikkat etmeli ve mikroskop örneklerini ışıktan, her türden korumalıdır. Leishmania fagositozunu çökelten tanımlanmış proteinlerin ekspresyonunun modüle edilmesi, bu proteinlerin Leishmania enfeksiyonu sonucundaki önemini gösterecektir.

Bu tekniği, terapötik stratejilerin geliştirilmesi için parazit oluşumu ve hedef belirleme ile ilişkili farklı patoloji çalışmalarına ve mekanizmalarına genişletebiliriz.