שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות

שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות. דגנים מלאים, כולל דגנים וקטניות, מהווים חלק ניכר מהתזונה האנושית. הרלוונטיות התזונתית שלהם לבני אדם הוכרה זה מכבר.

עם זאת, לאחרונה דווח על היתרונות הבריאותיים המגנים נוגדי החמצון שלהם. חומצות פנוליות הנמצאות בשכבות הדגנים החיצוניות של הדגנים ובציפוי הזרעים של הקטניות תורמות לתכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים. הם שולפים רדיקלים חופשיים שגורמים נזק חמצוני לביו-מולקולות.

שני הסוגים של חומצות פנוליות הנמצאות בדגנים מלאים הן חומצות הידרוקסיבנזואיות וחומצות הידרוקסיצינמיות. מחקר זה מספק שיטה פשוטה למיצוי חומצות פנוליות מדגנים מלאים וקביעת יכולת נוגדת החמצון במבחנה שלהן. השתמש בחמש דגימות דגנים מלאים למחקר זה, חיטת דורום, תירס צהוב, שעועית פרה שחורת עיניים, סויה ושעועית כליה אדומה.

שקלו במדויק 100 מיליגרם של דגימת הקמח המלא ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בצבע ענבר, בעל קיבולת של שני מיליליטרים. הצבע הכהה של הצינור מסייע למנוע חשיפה של התערובת לאור. הוסיפו מיליליטר אחד של 80% מתנול מימי לכל אחד מהצינורות המכילים דוגמאות.

מערבולת לזמן קצר כדי לערבב את תמיסת מתנול ואת המדגם. Sonicate את הדגימות במשך 60 דקות כדי לחלץ את התרכובות הפנוליות המסיסות בחינם. שים כיסוי על הדגימות למשך משך הסוניקה להגנה נוספת מפני אור.

לאחר הסוניקציה, צנטריפוגה התערובות ב 20, 000 פעמים G במשך חמש דקות כדי להקדיש את שאריות מוצק, משאיר את supernatant על גבי. תרכובות פנוליות חופשיות יהיו קיימות בסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה. יש לסנן את ה-supernatant לפני ההזרקה למכשיר ה-HPLC.

כדי לסנן את המזרק, הסר את הבוכנה של מזרק 3 מ”ל והצמד מסנן מזרק. המסנן צריך להיות בגודל נקבובית לא גדול מ 0.22 מיקרומטר. פיפטה כ-0.4 מיליליטרים של ה-supernatant לתוך החלק העליון של המזרק.

הכנס מחדש את הבוכנה ודחף את הנוזל דרך המסנן לתוך בקבוקון HPLC המכיל תוספת בקבוקון. לאחר שהמכשיר הוגדר להפעלת השיטה המתוארת בכתב היד לניתוח HPLC, טען את הבקבוקונים לתוך הקרוסלה כדי להתאים לרשימת הדגימות. קבל כרומטוגרמות HPLC ב-320 ננומטר ו-280 ננומטר, המציגות פסגות שונות המייצגות תרכובות פנוליות שונות.

באמצעות עקומות סטנדרטיות מתאימות, כימתו חומצות הידרוקסיצינמיות ב-320 ננומטר מכיוון שיש להן ספיגה מקסימלית באורך גל זה. על פי אותו עיקרון, לכמת חומצות הידרוקסיבנזואיות ב 280 ננומטר. השתמשו ב-Trolox, אנלוגיה מסיסה במים של ויטמין E, כסטנדרט כדי להעריך את היכולת נוגדת החמצון במבחנה של תמציות הדגנים המלאים.

שקלו במדויק מיליגרם אחד של טרלוקס לתוך צינור פלקון. להמיס עם ארבעה מיליליטרים של 50% מתנול מימי כדי להכין תמיסת מלאי של מילימול אחד לליטר, שזהה ל 1000 מיקרומול לליטר. הכינו שישה ריכוזים של Trolox שהם 50, 100, 200, 400, 600 ו-800 מיקרומול לליטר כדי להתוות עקומות סטנדרטיות להערכת יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH והיכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox, TEAC.

באופן דומה, הכינו ריכוזי Trolox של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרומול לליטר להערכת יכולת הספיגה של רדיקלי חמצן, ORAC. הרכיבו את הנפח הכולל של כל ריכוז ל-500 מיקרוליטרים, כפי שמוצג בטבלה הראשונה. דיללו את תמציות הדגימה עם מתנול לפני הניתוח.

כאן, תמציות תירס צהוב ופרות דוללו פעמיים. תמציות החיטה ופולי הכליה דוללו חמש פעמים, בעוד תמצית הסויה דוללה 10 פעמים במתנול. שקלו 8.23 מיליגרם של ABTS לתוך צינור צנטריפוגות מיקרו ענברי נקי בעל קיבולת של שני מיליליטרים.

לאחר מכן, שקלו 1.62 מיליגרם של אשלגן פרסולפט לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו-צנטריפוגה נקי של שני מיליליטרים. ממיסים כל אחד מהכימיקלים השקולים במים מזוקקים מיליליטר אחד על ידי מערבולת. התוצאה היא תמיסת ABTS של 16 מילימולר ותמיסת פרסולפט של שישה מילימולרים.

הכן את תמיסת מלאי ABTS על ידי ערבוב תמיסות ABTS ואשלגן פרסולפט בכמויות שוות. הפתרון ישתנה מיד לצבע כהה. אפשרו לתערובת זו לדגור בחושך במשך 12 עד 16 שעות.

דיללו את תמיסת המניות של ABTS פי 30 עם 200 מילולרית עם תמיסת מחיצת פוספט כדי ליצור את פתרון העבודה של ABTS. לשם כך, הוסף 58 מיליליטרים של 200 מילימולר PBS לשני מיליליטרים של פתרון העבודה ABTS. תמיסת העבודה תכיל 0.27 מילימולאר ABTS ו-0.1 מילימולאר אשלגן פרסולפט.

לצורך הניתוח, יש למקם 10 מיקרוליטרים של כל תמצית מדוללת במיקרו-לוחית של 96 בארות. הוסיפו 190 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה ABTS לכל באר ודגרו למשך 60 דקות. מדוד את הספיגה של תערובות התגובה ב-750 ננומטר בקורא מיקרו-לוחות.

השתמש בתקני Trolox בריכוזים הנעים בין 100 ל-800 מיקרומול לליטר כדי להתוות עקומת כיול. הבדיקה נוגדת החמצון DPPH דורשת תרכובת יוצרת רדיקלים, DPPH. שקלו 1.2 מיליגרם של DPPH לתוך צינור צנטריפוגה ריק בקיבולת של 15 מיליליטר.

ממיסים את ה-DPPH במתנול כדי להכין תמיסה של 60 מיקרומולרים. בדיקת ה-DPPH בודקת את היכולת של תמציות הדגימה לנטרל רדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי DPPH. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמצית דגימה לבארות המיקרו-פלטה.

לאחר מכן, הוסף 195 מיקרוליטרים של 60 מיקרומולר DPPH תמיסה מתאנולית ודגירה למשך 60 דקות. מדוד את הספיגה ב-515 ננומטר. השתמש בתקני Trolox כדי להתוות עקומת כיול.

איור ראשון מראה את המבנה של חומצות הידרוקסיבנזואיות שנמצאות בדגנים המלאים. במחקר הנוכחי, חומצה ונילית הייתה החומצה ההידרוקסיבנזואית היחידה שזוהתה. איור 2 מראה את המבנה של חומצות הידרוקסיצינמיות שנמצאות בדגנים מלאים.

במחקר הנוכחי זוהו בדגימות חומצות p-coumaric, caffeic וחומצות פרוליות. טבלה 2 מציגה את החומצות הפנוליות שזוהו בדגימות. כפי שצוין קודם לכן, חומצה ונילית הייתה החומצה ההידרוקסיבנזואית היחידה שזוהתה בדגימות.

הוא זוהה בתמצית הפרה בלבד. החומצה ההידרוקסיצינמית קפאית זוהתה רק בפולים בכליות, בעוד שחומצה p-קומרית זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה. חומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות והייתה החומצה הפנולית השלטת בדגימות.

הריכוז הכולל של החומצות הפנוליות לפי הסדר מהגדול ביותר לפחות היה בסדר סויה, פרה, תירס צהוב ושעועית כליה או שווה ערך, ואחריו חיטה. טבלה 3 הראתה את התכולה הפנולית הכוללת ואת היכולת נוגדת החמצון של הדגימות. היכולת נוגדת החמצון כללה את יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, TEAC, ORAC, והיכולת נוגדת החמצון הכוללת של הדגימות.

היכולת נוגדת החמצון הכוללת היא סכום הערכים DPPH, TEAC ו-ORAC. בדומה לטבלה השנייה, לסויה הייתה היכולת נוגדת החמצון הכוללת הגבוהה ביותר. עם זאת, במקום cowpea, זה היה דווקא שעועית הכליה כי היה השני הגבוה ביותר קיבולת נוגדת חמצון הכוללת, אם כי cowpea היה השני הגבוה ביותר תוכן חומצה פנולית הכוללת.

אנומליה זו קשורה למבנים של חומצות פנוליות בודדות ולהשפעה האנטגוניסטית האפשרית של החומצה ההידרוקסיבנזואית הווניל על ההשפעות נוגדות החמצון של חומצות הידרוקסיצינמיות ב cowpea. מחקר זה הגיע למסקנה כי דגנים מלאים שונים בהרכבי החומצה הפנולית שלהם. מבין הדגנים המלאים שנחקרו, סויה יש את הכמות הכוללת הגבוהה ביותר של חומצות פנוליות, ובהתאם, את היכולת נוגדת החמצון הגבוהה ביותר.