Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nano-differensialskanning fluorimetri for screening i fragmentbasert blyoppdagelse
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Overvåking av endringer i smeltetemperaturen til et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode for screening av fragmentbiblioteker av noen få hundre forbindelser. Vi presenterer en TSA-protokoll som implementerer robotisert nano-differensialskanning Fluorimetry (nano-DSF) for overvåking av iboende tryptofan fluorescens og lys back-scattering for fragmentscreening.
Transcript
Denne protokollen er nyttig for fragmenterte hovedoppdagelseskampanjer som et ekstra verktøy for å velge lovende fragmenter som varmekandidater. Nano DSO for fragmentscreening bruker en begrenset mengde umerket proteinprøve og kan rutinemessig brukes til nesten alle proteinmål. Denne metoden kan brukes til å screene alle samlinger av ligander.
eller for å verifisere varme fra de andre metodene. Ta ut en fragmentplate fra minus 20 eller minus 80 grader Celsius fryser og la den tine ved romtemperatur med mild risting på en benk topp shaker. Sentrifuger platen ved 500 ganger G i 30 sekunder for å samle eventuelle dråper som stikker til siden av brønnene.
Ta en MRC 2-brønns krystalliseringsplate og pipette 15 mikrolitere av proteinbestandsløsningen inn i hver subbrønn ved hjelp av en flerkanals pipette. For å sjekke fragment- og proteinplatedefinisjoner på Mygg, slå på nanodispenseren og sørg for at det ikke er noen hindringer rundt de bevegelige komponentene. Åpne det grafiske brukergrensesnittet, klikk på Oppsett-fanen og under Dekkkonfigurasjon kontroller om platetypen der forbindelsene leveres og den der proteinet overføres, allerede er til stede i listen over tilgjengelige plater.
Hvis ikke, klikker du Alternativer og deretter Plater og oppretter en ny platedefinisjon ved å fylle ut de riktige verdiene for egenskapstypen. Angi plateposisjonene under Dekkkonfigurasjon under Kategorien Oppsett . Ved hjelp av rullegardinmenyen velger du Grainier U bunnplate for posisjon en og MRC 2-brønnsplate for posisjon to og lagrer protokollen.
Plasser fragmentplaten i posisjon én og proteinplaten i posisjon to av dekket. I protokollfanen klikker du på Fil og velger protokollen som er lagret i forrige trinn for utlevering av fragmentene. Definer volumet på fragmentene som skal dispenseres som 0,3 mikroliter.
For en vanlig plate der kolonne én og 12 ikke inneholder fragmenter, definerer du startplasseringen til kolonne to og sluttplasseringen til kolonne 11. Hvis kolonne to eller 11 er tomme på noen plater, bruker du kolonne tre og 10 som start- og sluttverdier. Klikk Kjør for å starte programmet.
Etter dispensering, som tar omtrent to minutter, fjern proteinet og fragmentplatene fra roboten og forsegle dem med en selvklebende tetningsfilm. Sentrifuger proteinplaten kort ved 500 ganger G i 30 sekunder for å samle dråper som stikker til sidene brønnene før du går videre til neste trinn. Inspiser visuelt brønnene på proteinplaten for nedbør som kan ha skjedd på grunn av tilsetning av fragmentene.
Hvis nedbør observeres i mange brønner, reduser konsentrasjonen av fragmentene og gjenta eksperimentet. Slå på Prometheus-instrumentet. Trykk på Open Drawer på berøringsskjermen for å få tilgang til instrumentets kapillære lastemodul.
Fjern magnetstripen fra lastemodulen og rengjør speilet med etanol for å fjerne eventuelle støvpartikler. For å overføre en løsning fra proteinfragmentplaten til kapillærene, plasser proteinplaten og kapillærene ved siden av instrumentet for enkel tilgang til kapillærlastemodulen. Ta en kapillær som holder den i den ene enden og berør løsningen i proteinplaten med den andre enden av kapillæren for å overføre prøven.
Bruk alltid hansker og sørg for ikke å berøre kapillæren i midten, da urenheter fra hanskene vil påvirke målingen. Plasser kapillæren i den angitte posisjonen til holderen, sørg for at den er riktig justert og sentrert, gjenta disse trinnene for å fylle alle posisjoner i lastemodulen. På slutten plasserer du magnetstripen på toppen av kapillærene for å holde dem på plass og trykker på Lukk skuff for å starte Nano-DSF-eksperimentet.
Åpne Prometheus-programmets PR. ThermControl og opprett et nytt prosjekt ved å klikke Start ny økt. Først må du utføre en oppdagelsesskanning for å oppdage fluorescensen til prøvene. Endre lysstoffrørsignalet til prøvene ved å justere eksitasjonskraften til laseren.
For en termisk denaturering, klikk på Smelteskanning-fanen, sett starttemperaturen til 20 grader Celsius, slutttemperaturen til 95 grader Celsius og temperaturhellingen til en grad Celsius per minutt. Klikk deretter på Start måling. Frekvensfordeling av skiftet og smeltetemperaturen for ytre, kinetisk eller høyt uttrykt i kreft ett protein, regulatorisk tetratricopeptide gjenta domene av monopolar spindel kinase 1, og SARS-CoV-2 3c-lignende protease er vist her.
Negative verdier indikerer en reduksjon i smeltetemperaturen i nærvær av et fragment, mens en positiv verdi indikerer en økning i smeltetemperaturen. For Nsp5 har alle fragmenter en avstabiliserende effekt, mens for Hec1 og Mps1 observeres både stabiliserende og destabiliserende treff. Dette er en billig og rask metode for å skjerme fragmentbiblioteker.
Andre metoder som NMR eller røntgenkrystallografi kan vise nøyaktig binding av fragmenter, og de er også tilgjengelige gjennom INX-oppdagelse. Resultatene med coronavirus protease bidro til å foreslå nye forbindelser som kan utvikles til narkotika mot COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
