Biology
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In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris
Chapters
Summary July 28th, 2021
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Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.
Transcript
Cette méthode permet la visualisation en temps réel de différents événements, se déroulant dans la moelle osseuse de la souris crânienne, tels que les mégacaryocytes, étendant les proplaquettaires à l’intérieur des vaisseaux sinusoïdaux. Le principal avantage de cette technique est une chirurgie mineure nécessaire minimisant la réaction inflammatoire, permettant une visualisation in vivo des événements dans des conditions presque d’usine. Pour commencer, transportez la souris dans la salle d’imagerie.
Allumez le microscope et l’ordinateur et configurez les paramètres requis. Une fois que la souris a complètement anesthésique, placez la souris sur une plaque chauffante, chauffée à 37 degrés Celsius pour toutes les manipulations suivantes, rasez la tête et la gorge de la souris et appliquez le gel sur les yeux pour éviter la sécheresse. Placez la souris sur le dos et fixez les jambes antérieures avec du ruban chirurgical pour étirer la gorge.
Après avoir désinfecté la gorge, faites une incision de 0,7 à 1 centimètre sur la veine jugulaire droite ou gauche à l’aide de ciseaux et étirez le tissu conjonctif adjacent pour exposer la veine du jongleur externe sur le dessus du muscle pectoral. Remplissez le cathéter avec une solution saline physiologique chaude et stérile. Pénétrez le cathéter à travers le muscle pectoral, puis insérez le cathéter dans la veine.
Retirez doucement l’aiguille, connectez la seringue aux traceurs fluorescents et injectez le volume mort du cathéter. Placez une goutte de colle chirurgicale pour stabiliser le cathéter. Resservez soigneusement la souris à une position couchée.
Désinfectez le cuir chevelu avec de l’éthanol à 70% avec une serviette en papier tout en enlevant les poils lâches. Utilisez des ciseaux et des pinces à épiler fins stériles pour faire une incision en forme de T à la ligne médiane jusqu’à un centimètre entre les oreilles sur le cuir chevelu pour exposer le calvarium. Exposez le crâne avec une pince à épiler, puis utilisez des ciseaux et une pince à épiler pour retirer soigneusement le périoste.
Utilisez un coton-tige stérile imbibé et une solution saline physiologique pour enlever tout le périoste et tous les débris ou cheveux qui pourraient altérer l’imagerie. Rincez le crâne avec une solution saline pour éliminer toute trace de sang et séchez rapidement l’os avec un coton-tige. Appliquez le gel de colle sur l’anneau, placez l’anneau sur l’os exposé et maintenez-le pendant quelques secondes pour permettre à l’anneau de s’attacher fermement au crâne.
Humidifiez légèrement le crâne avec un coton-tige salin marié. Préparez la pâte dentaire au silicium en mélangeant soigneusement les composants bleus et jaunes à un rapport de un pour un. Scellez l’anneau en appliquant la pâte dentaire pour éviter les fuites pendant l’imagerie.
Retirez soigneusement toute pâte ou colle dentaire qui pourrait être entrée dans l’anneau. Remplissez ensuite l’anneau avec une solution saline pour vérifier la fuite. Placez la souris sur le support et placez une compresse pliée sous la tête de l’animal pour lever la tête et empêcher le détachement de l’anneau du crâne lorsqu’il est attaché au support.
Vissez l’anneau sur le porte-bloc. Placez le support et l’assemblage de la souris dans la chambre de microscope chauffée. Réglez les longueurs d’onde laser appropriées pour les quatre quatre choisis et récupérez les lumières émises.
À l’aide du cathéter inter jongleur, injectez 50 microlitres de solution 0,2 micromolaire du traceur fluorescent pour étiqueter le système vasculaire. Placez l’étage du microscope avec le support et la souris sous l’objectif du microscope. Assurez-vous que l’anneau est toujours rempli de solution saline et remplissez-le si nécessaire, et immergez l’objectif et la solution saline.
Utilisez l’épifluorescence pour localiser les vaisseaux de la moelle osseuse et observer les mégacaryocytes alignés le long des vaisseaux sinusoïdaux. Pour les acquisitions longues, configurez une acquisition s’ilenseux 3D avec une image de 384 par 384 pixels à l’aide d’un scanner à résonance Hertz de huit kilotz et d’un mode bidirectionnel. Utilisez la moyenne des lignes avec une bonne résolution, puis choisissez la taille de pas Z optimisée et configurez l’intervalle de temps nécessaire avant de commencer l’acquisition.
Pour des acquisitions courtes et rapides, choisissez un type d’acquisition d’espace, de temps et minimisez la taille de l’image. Si nécessaire, ajustez l’image au récipient en faisant pivoter le champ d’imagerie. Utilisez la vitesse d’analyse et l’analyse bidirectionnelle les plus élevées disponibles.
Minimisez la moyenne des lignes pour trouver le compromis optimal entre la définition de l’image et la rapidité de l’acquisition. N’acquérez qu’un seul plan Z et minimisez l’intervalle de temps pour l’acquisition. Pour mesurer la vitesse plaquettaire, 10 à 20 secondes d’acquisition devraient suffire.
Le traceur fluorescent a été administré par voie intraveineuse pour imager les vaisseaux sinusoïdaux de la moelle anastomosée dans la moelle osseuse du crâne, avec la direction d’écoulement représentée par la flèche. La vitesse plaquettaire fluorescente a été enregistrée dans chaque branche du vaisseau et une variation a été observée. Les vaisseaux sinusoïdaux présentent des écoulements complexes dus aux anastomoses, avec la présence d’une refusion d’écoulement et même d’une stase.
Les flèches indiquaient la direction opposée de l’écoulement à la bifurcation. La vitesse plaquettaire a également été mesurée pour les branches gauche et droite des vaisseaux indiquant une irrégularité au fil du temps dans chaque branche du vaisseau avec des phases d’accélération, de stase et de décélération. Différentes morphologies de proplaquettaires ont été observées, y compris des proplaquettaires à marges irrégulières, puis des proplaquettaires longées et des proplaquettaires épaisses et courtes.
Lorsque les mégacaryocytes ont étendu les proplaquettaires dans les zones d’écoulements complexes, les proplaquettaires ont été projetées d’une branche de vaisseau à l’autre, selon la direction de l’écoulement. Lors de l’arrêt du flux sanguin, les proplaquettaires se sont détendues et la souris a subi un arrêt cardiaque inattendu, ce qui a indiqué l’importance des forces hydrodynamiques dans l’allongement des proplaquettaires. La largeur et la longueur des proplaquettaires ont également été mesurées en largeur moyenne de 5,2 micromètres et une longueur maximale moyenne d’environ 185 micromètres a été observée.
Tracer la longueur des proplaquettaires en fonction du temps permet de visualiser le comportement des proplaquettaires pendant les phases d’allongement, de stase, voire de rétraction. La vitesse d’allongement moyenne d’environ 10 micromètres par minute a été observée. L’installation du cathéter, a permis l’injection de médicaments pour étudier les effets sur la formation de proplaquettaires ou d’autres événements d’intérêt en temps réel.
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