A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Profilering av H3K4me3 Modifiering i växter som använder klyvning under mål och tagning
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Detta protokoll presenterar en förfinad CUT&Tag-strategi för profilering av histonmodifieringar i växter.
Transcript
Det övergripande målet med experimentet var att identifiera proteinanslutna DNA-fragment i hela genomet, vilket återspeglade kromatinets status. För att uppnå detta mål utfördes tre specialoperationer. Först och främst isolerades de intakta kärnorna från växtceller.
För det andra erkändes modifieringar av kromatin av en specifik antikropp in situ. För det tredje, antikroppen som binder ett protein A-transpons fusionsprotein, Tn5 transposas, klyva kromatin in situ under aktivering av magnesiumjoner. DNA-fragmenten och kromatinmodifieringsbindningsplatserna integrerades sedan med adaptrar och gjordes redo för DNA-beredning.
Polymeraskedjereaktionsberikning förbättrad generationssekvensering. Epigenomik reglering på kromatisk nivå, inklusive DNA och histon modifieringar, beteenden av transkription faktorer och icke-kodning RNAs med sina rekryterade proteiner, leder till tidsmässig och rumslig kontroll av genuttryck. CUT&Tag-teknik utvecklad av Henikoff Lab är en enzymtjuderingsmetod för kromatin epigenomikprofilering med hög effektivitet.
Här använder vi bomullsbladen som experimentella material, och för att utföra kromatinprofilering med antikroppar från Histone H3 Lysine-4 Trimetylation som ett exempel. Vi tillhandahåller ett förfinat protokoll med video för CUT&Tag prestanda i växter. För varje provberedning med CUT&Tag samlades gram bomullsbladsvävnad in.
Bladet maldes till ett fint pulver med flytande kväve och överfördes till ett 50 ml falkrör som innehöll 25 ml kyld kärnisoleringsbuffert A.Buffertlösningen blandades försiktigt och röret inkuberades på is i fem minuter med mild skakning för att fördela materialet jämnt. Det snurrades sedan vid 500 relativa centrifugalkraft eller rcf, vid 4 grader Celsius, i fem minuter, för att bilda cellpelleten. Supernatanten dekanterades och pelleten återanvänds med 20 ml kyld kärnisoleringsbuffert B, kompletterad med 0,5%Triton.
Röret inverterades försiktigt för att återanvända pelleten helt. Den resulterande cell lysate filtrerades sedan med en kombination av två siktar, en 500-mesh sil användes ovanpå för att ta bort de större vävnadsresterna. Och en sikt med 1000 maskor användes på botten för att samla in kärnorna.
Valet av lämplig maskstorlek på siktarna beror på storleken på växternas kärnor. Sterilt filterpapper användes på baksidan av sikten för att absorbera en del av lysat och små cellrester. Lysat som innehåller kärnorna överfördes till ett färskt 1,5 milliliter centrifugrör och snurrades vid 300 rcf i fyra minuter, vid 4 grader Celsius grader Celsius för att samla kärnorna.
Efter centrifugering användes en pipettspets för att ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. En mängd av 800 mikroliter, en kärntvättbuffert tillsattes. Och röret inverterades försiktigt för att återanvända atomkärnorna.
Röret snurrades igen vid 300 rcf, i fyra minuter vid 4 grader Celsius. Efter totalt tre tvättar kombinerades de resulterande kärnorna i ett färskt 1,5 milliliter centrifugrör och snurrades vid 300 rcf i fyra minuter vid 4 grader Celsius. En pipettspets användes för att ta bort så mycket den återstående bufferten som möjligt.
Nästa steg var inkubationen av antikroppen. En alikvot på 50 mikroliter av atomkärnor återanvändes i 1 milliliter antikroppsbuffert kompletterad med EDTA, BSA, proteashämmande cocktail i digitonin. En alikvot på 150 mikroliter av nuklei suspension placerades i en färsk 1,5 milliliter rör för en reaktion, två mikroliter av antikroppar lades till varje rör.
I denna analys inrättades två biologiska replikat för anti-histon-H3-Lysin-4-Trimetylation antikropp och immunoglobulin G negativa kontrollgrupper efter antikroppen tillsattes. Lösningen blandades försiktigt, och rören lämnades på en horisontell shaker för hybridisering över natten vid fyra grader Celsius i 12 rpm. Nästa morgon togs rören ut och kärnorna tvättades med hjälp av 800 mikroliter av immun nederbörd tvätt buffert.
Röret inverterades försiktigt för blandning och det lämnades på horisontell skakapparat i fem minuter vid rumstemperatur i 12 rpm. Efter tvätt snurrades röret vid 300 rcf i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering avlägsnades supernatanten med hjälp av en pipettspets.
Detta upprepades för totalt tre tvättar. Efter den tredje tvätten snurrades röret en 300 rcf i två minuter vid fyra grader Celsius, och en pipettspets användes för att ta bort den återstående bufferten så mycket som möjligt. För att förbereda Tn5 transposasblandningen för inkubation.
En mikroliter transponering lades till varje 150 mikroliter av transposasinkubationsbufferten. Vi rekommenderar att du först förbereder blandningen av transposaslösning beroende på antalet reaktioner. Och sedan lägga till en alikvot på 150 mikroliter till varje rör.
Lösningen blandades försiktigt och lämnades på en horisontell skakapparat vid rumstemperatur i 12 rpm i två timmar. Rören blandades försiktigt var 10 till 15 minuter. Efter inkubation tvättades atomkärnorna tre gånger med 800 mikroliter av immun nederbörd tvättbuffert vid rumstemperatur för att ta bort den obundna Tn5 transposase.
Efter den tredje tvätten snurrades röret vid 300 rcf i två minuter vid fyra grader Celsius, och en pipettspets användes för att ta bort den återstående bufferten. För tagmentationssteget lades 300 mikroliter taggmentationsbuffert till reaktionsröret. Lösningen blandades väl och inkuberades vid 37 grader Celsius i en timme.
Efter inkubation tillkom 10 mikroliter av 0,5 mol per liter EDTA vid 30 mikroliter av 10%SDS för att bestämma reaktionen. Nästa 300 mikroliter av DNA-extraktion buffert lades till. Oregelbunden DNA-extraktion utfördes.
DNA-fragment upplöstes i 25 mikroliter sterilt vatten. 24 mikroliter användes för PCR förstärkning i NGS bibliotek konstruktion. Denna figur visar den intakta kärnor fläcken med DAPI i bilden, under ett mikroskop som får en tillräcklig mängd intakta och relativt rena kärnor är det kritiska steget för CUT&Tag.
Efter PCR överfördes två mikroliter och storleken på DNA kontrollerades på 1,5%agarose gel. Denna siffra visar att jämföra med immunoglobulin genen negativ kontroll. Huvuddelen av DNA-fragmenten från Histone H3 Lysine 4 Trimetylationsprovet bör variera från 280 till 500 baspar.
DNA-fragmenten kan renas och sedan profileras genom hög genomströmningssekvensering. Denna siffra visar resultaten generation sekvensering för anti-histon H3 Lysine 4 Trimetylation antikropp jämför med immunoglobulin G negativa kontrollgrupper. Denna teknik genererar DNA-biblioteken med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med en förenklad procedur jämfört med ChIP-seq.
CUT&Tag är en ny metod som fortfarande pågår.
Tags
Biologi nummer 182Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
