Udvikling af 3D-organiseret humant hjertevæv inden for en mikrofluidisk platform

Hjerte-kar-sygdomme er fortsat den vigtigste dødsårsag på verdensplan. Traditionelle in vitro-modeller er afhængige af monolayerkultur. Men hjertet, specielt hjertemusklen eller myokardiet, er komplekst i sin 3D anisotropi og cellulære sammensætning.

Derfor er det afgørende at forbedre kompleksiteten af vævssammensætningen inden for in vitro-modeller for bedre at efterligne både de cellulære bestanddele og strukturen af myokardiet. Her i dette arbejde demonstrerer vi en protokol for udvikling af et 3D-modent stamcelleafledt humant hjertevæv i en ny mikrofluidisk enhed. Denne enhed indeholder en 3D-hovedvævskanal med medfødte elliptiske mikropæle, der fremkalder høje grader af tilpasning af de omgivende hydrogel indkapslede hjerteceller.

Hovedkanalen er flankeret af mediekanaler med injektionsporte, der muliggør en næringsstofspredning i hele vævet. På grund af den omhu, der kræves ved håndtering af mikrofluidiske enheder, er visuel repræsentation af denne protokol nyttig til korrekt at etablere 3D-hjertevæv i en mikrofluidisk enhed med indlejrede mikroposter for forbedret vævsjustering. For at adskille den menneskelige hjertefibroblast skal du først tage kolben ud af inkubatoren.

Sæt inde i biosikkerhedsskabet og begynd at suge de brugte medier fra kolben. Derefter skal du tage tre MLs af PBS 1X for at vaske kolben. Luk hætten og svirr kolben, så bunden er korrekt belagt med PBS.

Indsug PBS. Tag tre MLs af 37 graders trypsin og tilsæt til kolben. Derefter vippe kolben og hvirvle, så bunden er helt belagt.

Sæt derefter inkubatoren i fire til seks minutter. Neutralisere trypsin med FGM3 ved at tage tre MLs og tilføje, at til kolben. Opløsningen pipetters op og ned for at løsne eventuelle celler, der forbliver på bagsiden af kolben.

Opsamles celleaffjedringen i et 15 ML Falcon-rør. Tag 10 mikroliter af celleaffjedringen og dispenser i et hæmocytometer for at tælle cellerne med et mikroskop. Centrifuge celleaffjedringen ved 250 G i fire minutter.

Efter centrifugering suges supernatanten til at være forsigtig med ikke at forstyrre cellepillen. Genbrug cellepille med frisk FGM3 for at lave de ønskede 75 millioner celler pr. ML-suspension. Genbrug cellerne, og sæt derefter røret ned med en løst monteret hætte.

For at adskille kardiomyocytterne skal du tage pladen ud af inkubatoren og aspirere medierne. Tag seks MLs af PBS og vask brøndene, så der er en ML PBS i hver brønd. Indsug PBS’en, og pas på ikke at forstyrre de celler, der er fastgjort til pladen.

Tilføj seks MLs af opvarmet trypLE Express, så der er en ML i hver brønd af en seks godt plade. Inkuber cellerne med trypLE i 10 minutter. Efter 10 minutter skal du neutralisere trypLE med seks MLs RPMI plus B27 plus insulin, så du tilføjer en ML RMPI til hver brønd.

Brug en ML-pipette til at opsamle opløsningen og sprænge den mod bagsiden af brøndene for at sikre, at alle celler løftes af. Opsamles celleaffjedringen i et 15 ML Falcon-rør. Centrifuge røret ved 300 G i tre minutter.

Efter centrifugering suges medierne og trypLE’en. Dette trin er vigtigt at vaske de følsomme kardiomyocytter. Dette trin sikrer, at alle trypLE er væk i 3D-hjertevævsdannelse.

Genbrug cellepillen i fem MLs af RPMI plus B27 plus insulin. Brug en ML-pipette til at pipette opløsningen op og ned for at sikre en homogen celleaffjedring. Tag 10 mikroliter af celleaffjedringen til optælling med hæmometeret.

Centrifuge cellerne ved 300 G i tre minutter. Aspirere medierne efter centrifugation for anden gang. Tilføj den passende mængde RPMI plus B27 plus insulin for at opnå en 75 millioner celler pr ML suspension, derefter genbruges.

For at forberede kollagenopløsningen til indkapsling skal alle reagenser være på en isboks i emhætten. Så tag 75 mikroliter af bestanden kollagen. Kollagenen er meget tyktflydende, så langsomt optagelse med pipetten, og dispenser derefter i et mikrocentrifugerør på is.

Tag 13,85 mikroliter RPMI og tilsæt til kollagen i Falcon-røret. Derefter tager 10 mikroliter phenolrød og tilsæt til blandingen på is og genbruges. Endelig skal du tage 1,15 mikroliter af en normal NaOH og tilføje til suspensionen for at neutralisere.

Så tag en 200 mikroliter pipette spids og genbruge suspensionen. Næste skridt er indkapsling af cellerne i kollagen metrogel. Så tag en aliquot af otte mikroliter af CMs og tilføje til en frisk Falcon rør på is.

Så tag to mikroliter af CS og tilføje til denne celle blanding. Genbrug celleaffjedringen og tag 5,6 mikroliter af celleaffjedringen og læg et frisk Falcon-rør i. Så tag det kollagen, du lige har forberedt, tag fire mikroliter af kollagen, og tag derefter 2,4 mikroliter metrogel.

Blandingen pipetters op og ned for at sikre en homogen fordeling af cellehydrogelaffjedringen. Når gelindsprøjtningen er forberedt, kan du indsætte i enheder. Tag et nyt tip og genbrug.

Tag petriskålen af enheder, indsæt spidsen i injektionsporten, og langsomt og støt injicere. Du vil se som enheden kanal fyldes op med cellen hydrogel suspension. Når den anden port er fyldt, skal du stoppe injektionen og fjerne spidsen.

Efter injektion skal du vende enhederne med pincet og placere inde i den større petriskål med vand i inkubatoren i ni minutter. Efter ni minutter skal du tage enhederne ud af inkubatoren og vende oprejst og derefter placere tilbage i inkubatoren i ni minutter mere for at fuldføre hydrogel polymerisering. Nu er det tid til at tilføje medierne.

Så tag RMPI plus B27 og indsæt spidsen i medieporten og begynd langsomt at skubbe. Så gør det på den modsatte medieport. Du kan opleve, at mediet ikke injicerer, så du kan lægge en dråbe medier oven på porten og derefter tage pipetten og bruge undertryk til at trække mediet igennem fra den anden side.

Så du vil se som medierne begynder at få trukket gennem kanalen. Når mediet er føjet til alle mediekanalerne, sættes enhederne tilbage i inkubatoren ved 37 grader. Den mikrofluidiske enhed vises i øverste venstre hjørne.

Dag et, syv og 14 af kulturen vises dette billede. Efter 14 dages kultur skal cellerne kondensere i stærkt justerede strukturer, der dannes omkring mikroposts. Spor af dag 14 er vist her i C af spontan sammentrækning, samt immunofluorescerende billeder af actin farvede og hjerte markør farvede væv.

Hvad der skal ses, er stærkt justerede actinfibre, der dannes efter 14 dage i kultur, samt parallelle striated modne sarkomere og lokaliserede hulkryds. Under denne procedure er det vigtigt at holde alle materialer ved lave temperaturer på is under cellehydrogelindsprøjtning for at forhindre for tidlig polymerisering. De mikrofluidiske enheder skal håndteres med forsigtighed, både under fabrikation, injektion og udvidet vævskultur.

Celleindsprøjtningerne skal være en stabil proces for at sikre, at hele kanalen er fyldt, mens den udføres hurtigt for at forhindre for tidlig polymerisering eller hydrogeludtørring før medietilsætning.