A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर 3डी संगठित मानव हृदय ऊतक का विकास
Chapters
Summary June 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कार्डियक इंजीनियरिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग में अनुप्रयोगों के लिए बायोमिमेटिक, कोलेजन आधारित हाइड्रोजेल के भीतर, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (सीएफएफ) के साथ स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स सह-सुसंस्कृत स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से बना अत्यधिक गठबंधन मानव हृदय ऊतक के त्रि-आयामी (3 डी) माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल के विकास को समझाना और प्रदर्शित करना है।
Transcript
हृदय रोग दुनिया भर में मौत का नंबर एक कारण बना हुआ है । पारंपरिक इन विट्रो मॉडल मोनोलेयर संस्कृति पर भरोसा करते हैं। हालांकि, दिल, विशेष रूप से दिल की मांसपेशी या मायोकार्डियम, इसकी 3 डी एनिसोट्रोपी और सेलुलर संरचना में जटिल है।
इसलिए, सेलुलर घटकों और मायोकार्डियम की संरचना दोनों की बेहतर नकल करने के लिए इन विट्रो मॉडल के भीतर ऊतक संरचना की जटिलता में सुधार करना महत्वपूर्ण है। यहां इस काम में, हम एक उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी परिपक्व स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक के विकास के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इस डिवाइस में जन्मजात अंडाकार माइक्रोपोस्ट के साथ एक 3डी मुख्य ऊतक चैनल शामिल है जो आसपास के हाइड्रोजेल के संरेखण की उच्च डिग्री को प्रेरित करता है कार्डियक कोशिकाओं को समझाया जाता है।
मुख्य चैनल इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ मीडिया चैनलों द्वारा घिरा हुआ है जो पूरे ऊतक में पोषक तत्वों का प्रसार सक्षम करता है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को संभालने में आवश्यक देखभाल के कारण, इस प्रोटोकॉल का दृश्य प्रतिनिधित्व उन्नत ऊतक संरेखण के लिए एम्बेडेड माइक्रोपोस्ट के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी कार्डियक ऊतक को ठीक से स्थापित करने में सहायक है। मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए, पहले इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें।
जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर रखो और फ्लास्क से खर्च किए गए मीडिया को आकांक्षी करना शुरू करें। इसके बाद फ्लास्क धोने के लिए पीबीएस 1X के तीन एमएलएस लें। टोपी बंद करें और फ्लास्क को घूमते हैं ताकि नीचे पीबीएस में ठीक से लेपित हो।
पीबीएस को आकांक्षी करें। 37 डिग्री ट्राइप्सिन के तीन एमएलएस लें और फ्लास्क में डालें। इसके बाद फ्लास्क और भंवर को झुकाएं ताकि नीचे पूरी तरह से लेपित हो।
इसके बाद इनक्यूबेटर में चार से छह मिनट तक लगा दें। तीन एमएलएस लेकर एफजीएम 3 के साथ ट्राइपसिन को बेअसर करें और उसे फ्लास्क में जोड़ दें। फ्लास्क के पीछे रहने वाली किसी भी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए। कोशिका निलंबन के 10 माइक्रोलीटर लें और एक हीमोसाइटोमीटर में बांटना एक माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की गिनती करने के लिए । चार मिनट के लिए 250 जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
अपकेंद्रित्र के बाद, अलौकिक को सेल पेलेट को परेशान न करने के लिए सावधान रहें। एक वांछित 75 मिलियन कोशिकाओं प्रति एमएल निलंबन बनाने के लिए ताजा FGM3 के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें, फिर ट्यूब को शिथिल फिट टोपी के साथ नीचे सेट करें।
कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए, प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और मीडिया को एस्पिरेट करें। पीबीएस के छह एमएलएस लें और कुओं को धोएं ताकि प्रत्येक कुएं में पीबीएस का एक एमएल हो। पीबीएस को एस्पिरेट करें, सावधान रहें कि प्लेट से जुड़ी कोशिकाओं को परेशान न करें।
गरम ट्रिप्ले एक्सप्रेस के छह एमएलएस जोड़ें ताकि एक छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक एमएल हो। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए ट्रिप्ले के साथ इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के बाद, आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन के छह एमएलएस के साथ ट्रिप्ले को बेअसर करें ताकि आप प्रत्येक अच्छी तरह से आरएमपीआई के एक एमएल को जोड़ रहे हैं।
समाधान एकत्र करने के लिए एक एमएल पिपेट का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को हटा लिया गया है। एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए। तीन मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें।
अपकेंद्रित्र के बाद, मीडिया और ट्रिप्ले को आकांक्षी करें। संवेदनशील कार्डियोमायोसाइट्स को धोने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि सभी ट्रिप्ले 3 डी कार्डियक ऊतक गठन में चला गया है।
आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन के पांच एमएलएस में सेल पेलेट को रीसस्ट करें। एक सजातीय सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए समाधान को ऊपर और नीचे पाइपेट करने के लिए एक एमएल पिपेट का उपयोग करें। हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनती के लिए सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर लें।
तीन मिनट के लिए 300 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। दूसरी बार अपकेंद्रित्र के बाद मीडिया को आकांक्षी । 75 मिलियन कोशिकाओं को प्रति एमएल निलंबन प्राप्त करने के लिए आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन की उचित मात्रा जोड़ें, फिर पुनर्सुंदर।
एनकैप्सुलेशन के लिए कोलेजन समाधान तैयार करने के लिए, हुड में एक आइसबॉक्स पर सभी रिएजेंट्स रखें। इसके बाद स्टॉक कोलेजन के 75 माइक्रोलीटर लें। कोलेजन बहुत चिपचिपा है, इसलिए धीरे-धीरे पिपेट के साथ तेज करें, फिर बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वितरित करें।
आरपीएमआई के 13.85 माइक्रोलीटर लें और फाल्कन ट्यूब में कोलेजन में जोड़ें। इसके बाद फिनॉल रेड के 10 माइक्रोलीटर लें और आइस और रिसिपेंड पर इस मिश्रण में डालें। अंत में, एक सामान्य नाओएच के 1.15 माइक्रोलीटर लें और बेअसर करने के लिए निलंबन में जोड़ें।
इसके बाद 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप लें और सस्पेंशन को रीसुस्पेंड करें। अगला कदम कोलेजन मेट्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का एनकैप्सुलेशन है। फिर सीएम के आठ माइक्रोलीटर का एक बहाना लें और बर्फ पर एक ताजा फाल्कन ट्यूब में जोड़ें।
इसके बाद सीएस के दो माइक्रोलीटर लें और उस सेल मिश्रण में डालें। सेल निलंबन को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन के 5.6 माइक्रोलीटर को पकड़ें और एक ताजा फाल्कन ट्यूब में डाल दें। फिर उस कोलेजन को पकड़ें जिसे आपने अभी तैयार किया है, कोलेजन के चार माइक्रोलीटर लें, फिर मेट्रोगेल के 2.4 माइक्रोलीटर लें।
सेल हाइड्रोगेल निलंबन का एक सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें। एक बार जेल इंजेक्शन तैयार हो जाने के बाद, आप उपकरणों में डाल सकते हैं। एक नया टोटका लें और रिस्पन करें।
उपकरणों की पेट्री डिश लें, इंजेक्शन पोर्ट में टिप डालें, और धीरे-धीरे और तेजी से इंजेक्ट करें। आप देखेंगे कि डिवाइस चैनल सेल हाइड्रोगेल निलंबन के साथ भरता है। एक बार दूसरे पोर्ट भर जाने के बाद इंजेक्शन बंद कर दें और टिप निकाल लें।
इंजेक्शन के बाद, चिमटी के साथ उपकरणों को फ्लिप करें और नौ मिनट के लिए इनक्यूबेटर में पानी के साथ बड़े पेट्री डिश के अंदर रखें। नौ मिनट के बाद, उपकरणों को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और सीधा फ्लिप करें, फिर हाइड्रोजेल बहुलीकरण को पूरा करने के लिए नौ और मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। अब मीडिया को जोड़ने का समय आ गया है ।
तो, आरएमपीआई प्लस बी 27 लें और मीडिया पोर्ट में टिप डालें और धीरे-धीरे धक्का देना शुरू करें। फिर विपरीत मीडिया पोर्ट पर ऐसा करते हैं । आप पा सकते हैं कि मीडिया इंजेक्शन नहीं लगा रहा है, इसलिए आप बंदरगाह के शीर्ष पर मीडिया की एक बूंद डाल सकते हैं और फिर पिपेट ले सकते हैं और मीडिया को दूसरी तरफ से खींचने के लिए नकारात्मक दबाव का उपयोग कर सकते हैं ।
तो आप देखेंगे के रूप में मीडिया के लिए चैनल के माध्यम से खींच लिया शुरू होता है । एक बार मीडिया मीडिया चैनलों के सभी के लिए जोड़ा गया है, उपकरणों ३७ डिग्री पर इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया जाएगा । ऊपरी बाएं हाथ के कोने में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस दिखाया गया है।
दिन एक, सात, और संस्कृति के 14 इस छवि को दिखाया गया है । संस्कृति के 14 दिनों के बाद, कोशिकाओं को अत्यधिक गठबंधन संरचनाओं में गाढ़ा होना चाहिए जो माइक्रोपोस्ट के चारों ओर बनते हैं। 14 दिन के निशान यहां सहज संकुचन के सी में दिखाए जाते हैं, साथ ही ऐक्टिन दाग और हृदय मार्कर दाग ऊतकों की इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियां भी दिखाई जाती हैं।
क्या देखा जाना चाहिए अत्यधिक गठबंधन actin फाइबर है कि संस्कृति में 14 दिनों के बाद फार्म, साथ ही समानांतर striated परिपक्व sarcomeres और स्थानीय अंतर जंक्शनों । इस प्रक्रिया के दौरान, समय से पहले बहुलीकरण को रोकने के लिए सेल हाइड्रोजेल इंजेक्शन के दौरान बर्फ पर कम तापमान पर सभी सामग्रियों को रखना महत्वपूर्ण है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को निर्माण, इंजेक्शन और विस्तारित ऊतक संस्कृति दोनों के दौरान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
सेल इंजेक्शन यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्थिर प्रक्रिया होनी चाहिए कि मीडिया के अलावा से पहले समय से पहले बहुलकीकरण या हाइड्रोगेल को सुखाने से रोकने के लिए पूरे चैनल ने जल्दी से प्रदर्शन किया है।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
