Utvikle 3D-organisert humant hjertevev i en mikrofluidisk plattform

Kardiovaskulær sykdom er fortsatt den viktigste dødsårsaken over hele verden. Tradisjonelle in vitro-modeller er avhengige av monolayerkultur. Imidlertid er hjertet, spesielt hjertemuskelen eller myokardiet, komplekst i sin 3D-anisotropi og cellulære sammensetning.

Derfor er det viktig å forbedre kompleksiteten i vevssammensetningen i in vitro-modeller for bedre å etterligne både cellulære bestanddeler og myokardiets struktur. Her i dette arbeidet demonstrerer vi en protokoll for utvikling av et 3D modent stamcelle-avledet menneskelig hjertevev i en ny mikrofluidisk enhet. Denne enheten inkorporerer en 3D hovedvevskanal med medfødte elliptiske mikroposter som induserer høye grader av justering av de omkringliggende hydrogelinnkapslede hjertecellene.

Hovedkanalen er flankert av mediekanaler med injeksjonsporter som muliggjør næringsspredning i hele vevet. På grunn av den omsorg som kreves for å håndtere mikrofluidiske enheter, er visuell representasjon av denne protokollen nyttig for å etablere 3D-hjertevev riktig i en mikrofluidisk enhet med innebygde mikroposter for forbedret vevsjustering. For å dissosiere den menneskelige hjertefibroblasten, ta først ut kolben fra inkubatoren.

Sett inn i biosikkerhetsskapet og begynn å aspirere de brukte mediene fra kolben. Ta deretter tre MLs PBS 1X for å vaske kolben. Lukk hetten og virvle kolben slik at bunnen er riktig belagt i PBS.

Aspirer PBS. Ta tre MLs av 37 graders trypsin og legg til kolben. Vipp deretter kolben og virvle slik at bunnen er helt belagt.

Sett deretter inn inkubatoren i fire til seks minutter. Nøytraliser trypsin med FGM3 ved å ta tre MLs og legge det til kolben. Pipette løsningen opp og ned for å løsne celler som forblir på baksiden av kolben.

Samle cellefjæringen i et 15 ML Falcon-rør. Ta 10 mikroliter av cellefjæringen og dispenser i et hemocytometer for å telle cellene med et mikroskop. Sentrifuger cellefjæringen ved 250 G i fire minutter.

Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og er forsiktig så du ikke forstyrrer cellepelleten. Resuspend cellepellet med fersk FGM3 for å lage ønsket 75 millioner celler per ML suspensjon. Resuspend cellene, og sett deretter røret ned med en løst montert hette.

For å dissosiere kardiomyocyttene, ta platen ut av inkubatoren og aspirer media. Ta seks ML PBS og vask brønnene slik at det er én ML PBS i hver brønn. Aspirer PBS, vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellene som er festet til platen.

Tilsett seks ML varmede trypLE Express slik at det er én ML i hver brønn på seks brønnplater. Inkuber cellene med trypLE i 10 minutter. Etter 10 minutter nøytraliserer du trypLE med seks ML RPMI pluss B27 pluss insulin, slik at du legger til en ML RMPI til hver brønn.

Bruk en ML pipette for å samle løsningen og sprenge den mot baksiden av brønnene for å sikre at alle cellene løftes av. Samle cellefjæringen i et 15 ML Falcon-rør. Sentrifuger røret ved 300 G i tre minutter.

Etter sentrifugering aspirerer du media og trypLE. Dette trinnet er viktig for å vaske de følsomme kardiomyocyttene. Dette trinnet sikrer at all trypLE er borte i 3D hjertevevsdannelse.

Resuspend cellepellet i fem MLs av RPMI pluss B27 pluss insulin. Bruk en ML pipette for å pipette oppløsningen opp og ned for å sikre en homogen celleoppheng. Ta 10 mikroliter av cellefjæringen for telling med hemocytometeret.

Sentrifuger cellene ved 300 G i tre minutter. Aspirer media etter sentrifugering for andre gang. Tilsett riktig mengde RPMI pluss B27 pluss insulin for å oppnå en 75 millioner celler per ML suspensjon, og deretter resuspend.

For å forberede kollagenoppløsningen for innkapsling, ha alle reagensene på en isboks i hetten. Ta deretter 75 mikroliter av lager kollagenet. Kollagenet er veldig viskøs, så sakte opptak med pipetten, og dispenser deretter i et mikrocentrifugerør på is.

Ta 13,85 mikroliter RPMI og legg til kollagenet i Falcon-røret. Ta deretter 10 mikroliter fenolrød og legg til blandingen på is og resuspend. Til slutt, ta 1,15 mikroliter av en vanlig NaOH og legg til suspensjonen for å nøytralisere.

Ta deretter en 200 mikroliter pipettespiss og resuspend suspensjonen. Neste trinn er innkapsling av cellene i kollagen metrogel. Ta deretter en aliquot på åtte mikroliter CMs og legg til et friskt Falcon-rør på is.

Ta deretter to mikroliter CS og legg til den celleblandingen. Resuspend celle suspensjon og ta 5,6 mikroliter av celle suspensjon og sette i en frisk Falcon rør. Ta deretter tak i kollagenet du nettopp forberedte, ta fire mikroliter av kollagenet, og ta deretter 2,4 mikroliter metrogel.

Pipette blandingen opp og ned for å sikre en homogen fordeling av cellehydrgelfjæringen. Når gelinjeksjonen er forberedt, kan du sette inn i enheter. Ta et nytt tips og resuspend.

Ta Petri-parabolen på enhetene, sett spissen inn i injeksjonsporten, og injiser sakte og jevnt. Du vil se når enhetskanalen fylles opp med cellehydrgelfjæringen. Når den andre porten er fylt, stopp injeksjonen og fjern spissen.

Etter injeksjon, vend enhetene med pinsett og plasser inne i den større Petri-parabolen med vann i inkubatoren i ni minutter. Etter ni minutter, ta enhetene ut av inkubatoren og vend oppreist, og plasser deretter tilbake i inkubatoren i ni minutter for å fullføre hydrogelpolymerisering. Nå er det på tide å legge til media.

Så ta RMPI pluss B27 og sett spissen inn i medieporten og begynn sakte å skyve. Gjør det deretter på motsatt medieport. Du kan oppleve at mediet ikke injiserer, slik at du kan sette et dråpe medier på toppen av porten og deretter ta pipetten og bruke negativt trykk for å trekke mediet gjennom fra den andre siden.

Så du vil se når media begynner å bli trukket gjennom kanalen. Når media er lagt til alle mediekanalene, vil enhetene bli satt tilbake i inkubatoren ved 37 grader. Den mikrofluidiske enheten vises øverst til venstre.

Dager én, syv og 14 av kulturen vises dette bildet. Etter 14 dager med kultur, bør cellene kondensere til svært justerte strukturer som dannes rundt mikropostene. Spor av dag 14 er vist her i C av spontan sammentrekning, samt immunfluorescent bilder av aktin farget og hjertemarkør farget vev.

Det som bør sees er høyt justerte aktinfibre som dannes etter 14 dager i kulturen, samt parallelle strikkede modne sarkomer og lokaliserte gapkryss. Under denne prosedyren er det viktig å holde alle materialer ved lave temperaturer på is under cellehydrgelinjeksjon for å forhindre for tidlig polymerisering. De mikrofluidiske enhetene bør håndteres med forsiktighet, både under fabrikasjon, injeksjon og utvidet vevskultur.

Celleinjeksjonene bør være en jevn prosess for å sikre at hele kanalen har fylt mens den utføres raskt for å forhindre for tidlig polymerisering eller hydrogeltørking før medietilsetning.