A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utveckla 3D organiserad mänsklig hjärtvävnad inom en mikrofluidisk plattform
Chapters
Summary June 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Målet med detta protokoll är att förklara och demonstrera utvecklingen av en tredimensionell (3D) mikrofluidisk modell av högjusterad mänsklig hjärtvävnad, bestående av stamcellsbaserade kardiomyocyter som odlas med hjärtfibroblaster (CFs) inom en biomimetisk, kollagenbaserad hydrogel, för tillämpningar inom hjärtvävnadsteknik, läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering.
Transcript
Hjärt-kärlsjukdom är fortfarande den främsta dödsorsaken i världen. Traditionella in vitro-modeller förlitar sig på monolayerkultur. Hjärtat, särskilt hjärtmuskeln eller hjärtmuskeln, är dock komplext i sin 3D-anisotropi och cellulära sammansättning.
Därför är det viktigt att förbättra komplexiteten i vävnadssammansättningen inom in vitro-modeller för att bättre efterlikna både cellulära beståndsdelar och myokardiets struktur. Här i detta arbete demonstrerar vi ett protokoll för utveckling av en 3D mogen stamcells-härledd mänsklig hjärtvävnad inom en ny mikrofluidisk enhet. Denna anordning innehåller en 3D huvudvävnad kanal med medfödda elliptiska mikroposter som inducerar höga grader av inriktning av den omgivande hydrogel inkapslade hjärtceller.
Huvudkanalen flankeras av mediekanaler med injektionsportar som möjliggör näringsspridning i hela vävnaden. På grund av den vård som krävs vid hantering av mikrofluidiska enheter, visuella representation av detta protokoll är till hjälp för att korrekt fastställa 3D hjärtvävnad inom en mikrofluidisk enhet med inbäddade mikroposter för förbättrad vävnad justering. För att skilja den mänskliga hjärtfibroblasten, ta först ut kolven från inkubatorn.
Sätt i biosäkerhetsskåpet och börja aspirera det använda mediet från kolven. Ta sedan tre MLs pbs 1X för att tvätta kolven. Stäng locket och snurra kolven så att botten är ordentligt belagd i PBS.
Aspirera PBS. Ta tre MLs av 37 graders trypsin och lägg i kolven. Luta sedan kolven och snurra så att botten är helt belagd.
Lägg sedan inkubatorn i fyra till sex minuter. Neutralisera trypsin med FGM3 genom att ta tre MLs och lägga till det i kolven. Pipett lösningen upp och ner för att lossa alla celler som finns kvar på kolvens baksida.
Samla cellupphängningen i ett 15 ML Falcon-rör. Ta 10 mikroliter av cellupphängningen och dispensera i en hemocytometer för att räkna cellerna med ett mikroskop. Centrifugera cellupphängningen vid 250 G i fyra minuter.
Efter centrifugation, aspirera supernatanten var försiktig så att den inte stör cellpelleten. Återanvänd cellpelleten med färsk FGM3 för att göra önskade 75 miljoner celler per ML suspension. Återanvänd cellerna och ställ sedan ner röret med ett löst monterat lock.
För att skilja kardiomyocyterna åt, ta ut plattan ur inkubatorn och aspirera på media. Ta sex MLs PBS och tvätta brunnarna så att det finns en ML PBS i varje brunn. Aspirera PBS, var försiktig så att du inte stör cellerna som är fästa vid plattan.
Lägg till sex MLs av uppvärmd trypLE Express så att det finns en ML i varje brunn på en sex brunnsplatta. Inkubera cellerna med trypLE i 10 minuter. Efter 10 minuter neutraliserar du trypLE med sex MLs RPMI plus B27 plus insulin så att du lägger till en ML RMPI till varje brunn.
Använd en ml-pipett för att samla lösningen och spräng den mot brunnens ryggar för att säkerställa att alla celler lyfts av. Samla cellupphängningen i ett 15 ML Falcon-rör. Centrifugera röret vid 300 G i tre minuter.
Efter centrifugation, aspirera media och trypLE. Detta steg är viktigt för att tvätta de känsliga kardiomyocyterna. Detta steg säkerställer att all trypLE är borta i 3D hjärtvävnadsbildning.
Återanvänd cellpelleten i fem MLs RPMI plus B27 plus insulin. Använd en ml-pipett för att pipettera lösningen upp och ner för att säkerställa en homogen cellfjädring. Ta 10 mikroliter av cellupphängningen för att räkna med hemocytometern.
Centrifugera cellerna vid 300 G i tre minuter. Aspirera media efter centrifugation för andra gången. Tillsätt lämplig mängd RPMI plus B27 plus insulin för att uppnå 75 miljoner celler per ML-suspension och återanvänd sedan.
För att förbereda kollagenlösningen för inkapsling, ha alla reagenser på en islåda i huven. Ta sedan 75 mikroliter av lagerkollage. Kollagenet är mycket trögflytande, så långsamt upptag med pipetten och dispenseras sedan i ett mikrocentrifugrör på is.
Ta 13,85 mikroliter RPMI och lägg till kollagenet i Falcon-röret. Ta sedan 10 mikroliter fenolrött och lägg till blandningen på is och återanvänd. Slutligen ta 1,15 mikroliter av en normal NaOH och lägg till suspensionen för att neutralisera.
Ta sedan en 200 mikroliter pipettspets och återanvänd suspensionen. Nästa steg är inkapsling av cellerna i kollagenmeträngeln. Ta sedan en alikvot på åtta mikroliter CMs och lägg till ett färskt Falcon-rör på is.
Ta sedan två mikroliter CS och lägg till den cellblandningen. Återanvänd cellfjädringen och ta tag i 5,6 mikroliter av cellupphängningen och lägg i ett nytt Falcon-rör. Ta sedan kollagenet som du just förberedde, ta fyra mikroliter av kollagenet och ta sedan 2,4 mikroliter metrogel.
Pipetten blandningen upp och ner för att säkerställa en homogen fördelning av cellhydelsuspensionen. När gelinjektionen är förberedd kan du sätta in i enheter. Ta ett nytt tips och återanvänd.
Ta petriskålen med enheter, sätt in spetsen i injektionsporten och injicera långsamt och stadigt. Du ser när enhetskanalen fylls med cellhydelupphängningen. När den andra porten är fylld, stoppa injektionen och ta bort spetsen.
Efter injektionen, vänd enheterna med pincett och placera inuti den större Petri-skålen med vatten i inkubatorn i nio minuter. Efter nio minuter, ta enheterna ur inkubatorn och vänd upprätt och placera sedan tillbaka i inkubatorn i ytterligare nio minuter för att slutföra hydrogelpolymerisationen. Nu är det dags att lägga till media.
Så ta RMPI plus B27 och sätt in spetsen i medieporten och börja långsamt trycka. Gör det sedan på den motsatta medieporten. Du kanske upptäcker att mediet inte injicerar, så du kan lägga en droppe media ovanpå porten och sedan ta pipetten och använda undertryck för att dra igenom mediet från andra sidan.
Så du kommer att se när media börjar dras genom kanalen. När media har lagts till i alla mediekanaler kommer enheterna att sättas tillbaka i inkubatorn vid 37 grader. Den mikrofluidiska enheten visas i det övre vänstra hörnet.
Dag ett, sju och 14 av kulturen visas denna bild. Efter 14 dagars kultur bör cellerna kondensera till mycket anpassade strukturer som bildas runt mikroposterna. Spår av dag 14 visas här i C av spontan sammandragning, liksom immunofluorescerande bilder av aktin färgade och hjärt markör färgade vävnader.
Vad som bör ses är mycket anpassade aktinfibrer som bildas efter 14 dagar i kultur, liksom parallella strimmiga mogna sarkomerer och lokaliserade gapkorsningar. Under denna procedur är det viktigt att hålla alla material vid låga temperaturer på is under cellhydelinjektion för att förhindra för tidig polymerisation. Mikrofluidiska enheter bör hanteras varsamt, både under tillverkning, injektion och utökad vävnadskultur.
Cellinjektionerna bör vara en stadig process för att säkerställa att hela kanalen har fyllts medan den utförs snabbt för att förhindra för tidig polymerisation eller hydrogeltorkning före tillsats av media.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
