Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Bedömning av respiratoriska immunsvar mot Haemophilus influenzae
Chapters
Summary June 29th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Haemophilus influenzae inducerar inflammation i luftvägarna. Denna artikel kommer att fokusera på användningen av flödescytometri och konfokalmikroskopi för att definiera immunsvar av fagocyter och lymfocyter som svar på denna bakterie.
Transcript
Haemophilus influensa är en viktig orsak till inflammation i olika kroniska lungsjukdomar inklusive KOL och lunginflammation. Detta protokoll beskriver metoder för att bedöma effekten av hemofilus på lunginflammation. Fördelarna med denna teknik är att den möjliggör en omfattande bedömning av medfödda och adaptiva immunsvar.
Inkubera 450 mikroliter perifert blod med 50 mikroliter av en aktiverad propidiumjodid märkt H influenzae i ett fem milliliter rör i 20 minuter i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Ta bort provet från vattenbadet, tillsätt fem mikroliter DHR och virvel i 10 sekunder. Placera sedan tillbaka den i vattenbadet i ytterligare 10 minuter.
Efter att ha tagit bort provet från vattenbadet, lysera erytrocyterna med fem milliliter 0,8% ammoniumkloridlösning och analysera proverna på en flödescytometer som beskrivs i texten. Dela upp det perifera blodprovet i alikvoter för kontroll och antigenstimulering. Tillsätt kostimulatoriska antikroppar till båda proverna.
Tillsätt sedan den icke-typbara H-influensan till antigenprovet och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i en timme. Tillsätt sedan Golgi-blockeringsmedlet brefeldin A till proverna och inkubera dem i ytterligare fem timmar. Efter lysering av erytrocyterna som visats tidigare, fixera leukocyterna med användning av 500 mikroliter av en till 2% para-formaldehyd i en timme.
Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, permeabilisera sedan 1 miljon celler med 100 mikroliter 0,1% saponin i 15 minuter. Därefter inkubera cellerna med lämpliga fluorescerande märkta antikroppar. Tvätta cellerna och analysera dem sedan med hjälp av en flödescytometer.
Bestäm andelen antigensvarande celler genom att få relevanta lymfocytpopulationer. Utför bakgrundsfärgning på icke-stimulerade celler för alla cytokiner som ska analyseras. Skiva cirka 20 till 40 gram av lobektomiprovet i tre till fem kubikmillimeter sektioner.
Placera dem i en steril 50 mikroliter kammare och fragmentera vävnaden mekaniskt med en lämplig disaggregator. Efter vävnadsuppdelning, lysera de röda blodkropparna som demonstrerats och återsuspendera cellerna i steril RPMI. Filtrera sedan cellerna genom ett 100 mikrometer sterilt nylonnät och räkna de livskraftiga cellerna med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden.
För infektionsanalysen, återsuspendera lungcellerna i RPMI till en slutlig koncentration av 4 miljoner celler per milliliter per rör. Infektera sedan cellerna med en MOI på 100 bakterier per cell. Lossa locket en halv rotation för att tillåta gasöverföring i rören.
Placera cellerna i rörrotatorn och inkubera dem vid 37 grader Celsius medan de roterar vid 12 varv / min. En timme efter stimulering, tillsätt grefeldin A för att förhindra extracellulär export av cytokiner och inkubera cellsuspensionerna i ytterligare 16 till 22 timmar med rotation. Följande dag, tvätta cellsuspensionen med 500 mikroliter PBS innehållande 1% bovint serumalbumin och 0,01% natriumazid.
Därefter färga cellsuspensionen för specifika humana lymfocyter cellytmarkörer i en timme. Tvätta sedan cellerna med PBS och fixa och permeabilisera dem som visats tidigare. Därefter inkubera cellerna med intracellulära cytokinfärgningsantikroppar i en timme.
Tvätta sedan cellerna och återsuspendera dem i 100 mikroliter PBS före datainsamling på en flödescytometer. Mät proteolys via verkan av metalloproteinaser, tillsätt fluoresceinmärkt gelatinsubstrat direkt på lungvävnadssektionsglasen. Placera bilderna horisontellt och inkubera dem i en ljusskyddad fuktad kammare vid 37 grader Celsius i en timme.
För att förbereda negativa kontroller, lägg till en x reaktionsbuffert utan fluorescerande gelatin i sektionerna för vidare analys. Mononukleära celler i perifert blod gated med hjälp av framåt- och sidospridda för att definiera fagocytpopulationen. Fagocytpopulationen definierades ytterligare av CD14-uttryck för att märka monocyterna.
ROS-mätning utfördes via oxidation av DHR 123 för att producera fluorescens. Medianfluorescensen för det stimulerade provet jämfördes med kontrollen. Intracellulär cytokinproduktion av lymfocyter mättes med hjälp av flödescytometri.
Celler analyserades först för deras uttryck av leukocytmarkören CD45 och sedan för CD tre och CD fyra, CD åtta. CD-tre, CD fyra positiva celler bedömdes för intracellulär cytokinproduktion i kontroll och stimulerade prover. Protasaktivitet mättes med NC två zymografi i ofixerade lungvävnadssektioner.
Fluorescerande färgning indikerade närvaron av MMP-aktivitet, som också samlokaliserades med uttrycket av kromatin. Att tillsätta antikroppar till lungvävnadsproverna kräver koncentration och färgning av cellerna kommer att kräva optimering i preliminära experiment. Supernatanten av lungvävnadsproverna kan analyseras ytterligare för andra inflammatoriska mediatorer med hjälp av tekniker som ELISA och Dessa tekniker kan användas för att bedöma effekten av potentiella terapier på lunginflammation.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
