A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie
Chapters
Summary April 25th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.
Transcript
Het beste principe van de fluorescentiecorrelatiespectroscopie, FCS, werd aanvankelijk uitgevonden in de jaren 1970. In de jaren 1990 werden belangrijke en vele verbeteringen voor FCS vastgesteld door te combineren met een confocale apparaatmicroscopie. Sindsdien wordt FCS gebruikt voor vele chemische en viruskuurtoepassingen, zoals moleculaire interacties en eiwitaggregatieanalyse.
Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen. Fluorescentiehelderheid zijn enkelvoudige deeltjes in werking van moleculaire grootte verklaard door diffusie-eigenschappen. Het is erg belangrijk bij het meten van eiwitaggregaties omdat het geprojecteerde levenscyclussen van moleculen kan bepalen, maar ook de homo- of heteropolymerisatie kan onderscheiden.
Hier introduceren we een procedure om diffusie van amyotrofische laterale sclerose geassocieerd met geaggregeerde vormeiwit te meten met behulp van FCS in cellysaten en levende cellen. Bereid 100 millimeter plastic schotel groeien Neuro2a cel zitten comfortabel in de normale groei medium. Bevestig de celconfluency.
Verwijder het medium. Voeg 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de derde patroonschaal en incubeer ze gedurende één minuut op 37 graden Celsius. Voeg 9,5 milliliter normaal groeimedium toe aan de schaal en hang ze op.
De celsuspensie wordt gemengd met trypanblauw om de dode cellen te bevlekken. Voeg suspensie toe aan de celtellingsdia. Tel het aantal cellen met behulp van de celteller of handmatig.
Controleer het live celnummer en hun levensvatbaarheid. Verdun de cel in het getelde medium met 1,0 maal 10 tot een vermogen van 5 per milliliter. Voeg twee milliliter celsuspensie toe aan de 35 millimeter plastic schaal voor cellysis of groeiruimteschaal voor live celmeting.
Incubeer het gerecht een dag op 37 graden Celsius. Bereid de volgende dag het mengsel van plasmide-DNA en de transfectiereagentia. Voeg het transfectiemengsel toe aan het celgetelde medium en incubeer de cellen gedurende 24 uur.
Een dag later. Controleer de GFP-expressie met behulp van een routinemicroscoop. Je kunt de zeer heldere TDP25-ingrediëntlichamen in cellen zien.
Cellyse moet worden uitgevoerd op de biochemische bank. Verwijder het medium in de schaal. Voeg twee milliliter PBS toe op 25 graden Celsius om als medium te wassen.
Verwijder de PBS. Leg de schaal op een aluminium plaat op de bovenkant van het gemalen ijs. Voeg onmiddellijk de 200 microliter lysis buffer toe aan de schaal.
Schraap de schaal met een celschraper. Herstel het lysaat met onopgelost celafval in een nieuwe buis van 1,5 millimeter. Centrifugeer het lysaat op vier graden Celsius.
Voor metingen van levende cellen moet u het medium vóór de meting vervangen door een nieuw medium. Controleer de celbevestiging met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Controleer ook de GFP-expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Gebruik een confocale microscoop-gecombineerd FCS-systeem. Schakel de 488 nanometer laser in. Stabiliseer het systeem minstens 30 minuten.
Stel het optische pad in. Gebruik een laser van 488 nanometer voor het directe licht. Gebruik een geschikte beam splitter en dichroic meters.
En ook fluorescentie fusers. Meestal gebruiken we afdekglaskamers voor kalibratie- en oplossingsmetingen. Voorzichtig, neem de afdekkamer.
Plaats het glasoppervlak op het lensscreeningspapier. Giet de FCS kalibratie. Voeg ook de Rhodamine 6G-oplossing toe.
Voeg het ultrapure water toe aan het doel. Gebruik de olie niet. Plaats de kamer op het microscooppodium.
Verplaats het werkgebied naar de juiste positie. Maak de pinhole-aanpassing en open de pinhole-aanpassingswizard. Bewaak de telsnelheid van het foton als grove beweging van het pinhole voor de x-richting.
De helderste positie werd terecht bepaald. Controleer vervolgens de telsnelheid van het foton als fijne beweging. De helderste positie is met succes bepaald Dit is de pinhole positie voor x-richting.
Zoek op dezelfde manier de helderste positie van het pinhole naar y-richting. De helderste positie voor y-richting werd ook met succes bepaald. Maak de x- en y-positie van het pinhole nog erger.
Het is beter om de pinhole positie aan te passen voor de meting van elke dag. Wanneer het livepad wordt gewijzigd, moet de pinhole-positie opnieuw worden aangepast. Maak een telsnelheid en bewaak het aantal telefoons.
Ga naar de CPM-bewakingsmodus. Tel de correctiering van het object dat u hebt uitgevoerd, zodat de CPM-waarde de hoogste is. Sluit het venster met de telsnelheid.
Begin met de Rhodamine 6G oplossingsmeting. Nadat de meting is voltooid, klikt u op de pasvorm om curve-fittinganalyse uit te voeren. Selecteer een model voor de montage van de oude correlatiefunctie.
Voor Rhodamine 6G selecteert u het model voor 1-componenten, 3-dimensionale diffusie met een triplettoestand. Stel de begintijd van de montage in door de rode lijn te verplaatsen. Klik op Alles passen om de montageberekening te starten.
Controleer de pasvormafwijking. Zorg ervoor dat de zijkanten zijn geplaatst en negatief, rond nul. Controleer de gemonteerde waarden.
Zorg ervoor dat de diffusietijd ongeveer tussen de 20-30 microseconden ligt. Bovendien is de structurele parameter van vier tot acht. Open het montagepaneel en selecteer een model voor de meting.
Voer dezelfde structurele parameterwaarde in het model in voor het voorbeeld in het deelvenster Passend. Zorg ervoor dat het type moet worden ingesteld als Opgelost. GFP-TDP25 meting in cellysaat.
Plaats het lysaat in de afdekkamer. Plaats het deksel om opdrogen van het lysaat te voorkomen. Plaats het podiumdeksel voor lichte schaduw.
Stel in het acquisitiepaneel het laservermogen, de meettijd en de herhalingen in. Start de acquisitie. Er werd een piek waargenomen.
Er werd weer een piek waargenomen. De piek geeft heldere moleculen aan die door het detectielichaam gaan. Spikes duiden op oplosbare oligomeren of aggregaten.
Maak een pasvorm om curve fitting analyse uit te voeren. Selecteer het model voor 2-componenten, 3-dimensionale diffusie met tripletstatus. Stel de begintijd van de montage in.
Klik op Alles passen. Controleer de gemonteerde waarden. SOD1-G85R getagd met GFP-meting in een levende cel.
In tegenstelling tot oplossingsmeting, raad ik aan om de heat stage incubator te gebruiken. Zet de celklindende schotel op het microscooppodium. Bevestig de scherpstelling en de positie met behulp van de oculaire.
Selecteer een meetcel. Zoom in en pas de celpositie aan met behulp van een snelle scanmodus. Maak de momentopname van de cellen met behulp van de modus voor langzame scansnelheid.
Selecteer een FCS-meetpositie met behulp van het gereedschap Positie. Het kruishaar geeft de meetpositie aan. Start de meting.
De lichte daling van het aantal foton's suggereert fotobleaching van GFP. Voer de curve-fitting uit. Representatieve resultaten van GFP-TDP25 in cellysaat worden weergegeven.
De bovenste grafiek een record van foton telling tarief. Waar pijlen zijn, is een piek, wat oplosbare oligomeren en aggregaten suggereert. De middelste grafiek vertegenwoordigt de oude correlatiefunctie.
De grijze lijn toont de lage, oude correlatiefunctie. De magentalijn toont de gemonteerde functie. De stippellijnen geven de begin- en eindtijden aan voor montage.
De onderste tabel toont de gemonteerde waarde. Vervolgens worden representatieve resultaten van SOD1-G85R-GFP in een levende cel weergegeven. De bovenste grafiek vertegenwoordigt een record van ons aantal foton.
De geleidelijke afname van de geregistreerde fotontelling werd waargenomen, wat wijst op fotobleaching van de GFP-groei voor verschillende metingen. Dit komt door de trage diffusiesnelheid in levende cellen. De middelste grafiek vertegenwoordigt de oude correlatiefunctie van SOD1.
De grijze lijn toont de lage, oude correlatiefunctie. De magentalijn toont de gemonteerde functie. De stippellijnen geven de begin- en eindtijden met montage aan.
De onderste tabel toont de gemonteerde waarden. Hier laten we u deze procedure zien om diffusie te meten van elke cel geassocieerd TDP-25 in cellysaat en alles wat mutant is van SOD1 in levende cellen met behulp van FCS. De oplosbare oligomeren en aggregatie in cellysaat kunnen vaak worden waargenomen als pieken of uitbarstingen.
Aan de andere kant worden dergelijke pieken in levende cellen zelden waargenomen, behalve mogelijk voor de hand liggende levende structuren. Een langzaam verspreidende soort mutante SOD1's voegt voor ons een gemiddelde helderheid toe voor enkele deeltjes zoals SOD1 homopolymerisatie binnenin. De hier getoonde procedure is eenvoudig en de moeite waard.
FCS bevat geen straling;direct slapende toestand. Het is gewoon jouw, en onze, verbeeldingskracht empathie.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
