जागते चूहों में वीवो इमेजिंग में दोहराया के लिए एक कपाल खिड़की का आरोपण

प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि वायरल इंजेक्शन कैसे करें और जागते हुए, सिर-संयमित चूहों में मस्तिष्क कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की कैसे प्रत्यारोपित करें। इस विधि का लाभ यह है कि न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की संरचना और गतिविधि को कई सत्रों में बार-बार चित्रित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि तंत्रिका कोशिकाओं को न्यूरोडेवलपमेंटल, या न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के मॉडल में कैसे बदल दिया जाता है, या क्या अनुभव-निर्भर प्लास्टिसिटी बिगड़ा हुआ है।

थूथन क्लैंप और कान सलाखों का उपयोग करके एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के लिए एक एनेस्थेटिक माउस को सुरक्षित करके शुरू करें। बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करते हुए, काटें और ललाट टांके पूर्वकाल से त्वचा को ब्रैग्मा तक लैम्ब्डा के पीछे ले जाएं। एक बाँझ आकार 11 कार्बन स्टील सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके, धीरे से खोपड़ी से सभी संयोजी ऊतक खुरचना।

एक दंत ड्रिल की मदद से, धीरे-धीरे हड्डी के पतले होने की सुविधा के लिए संकेंद्रित हलकों में उद्घाटन की रूपरेखा के साथ खोपड़ी की हड्डी को ड्रिल करें। प्रत्येक संकेंद्रित पास के बाद, ड्रिल किए गए क्षेत्र में एक बूंद, या खारा के दो जोड़ें, और ड्रिलिंग को फिर से शुरू करने से पहले खारा को कम से कम 10 सेकंड तक बैठने की अनुमति दें। धीरे से ठीक संदंश के साथ खोपड़ी की हड्डी के केंद्रीय क्षेत्र पर धक्का यह जांचने के लिए कि खोपड़ी पर्याप्त रूप से पतली है और चलती है।

सुनिश्चित करें कि अंतर्निहित वास्कुलचर जहां ड्रिलिंग हुई वह बरकरार है, और यह कि हड्डी टूट नहीं गई है। ध्यान से पतली हड्डी में एक लघु 15 डिग्री नुकीला ब्लेड डालें और कटौती करें और किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए खारा में भिगोए गए जेल फोम का उपयोग करें। संदंश का उपयोग करना, सावधानीपूर्वक उठाना और हड्डी को हटाना, ड्यूरा मेटर को नुकसान न पहुंचाने का ख्याल रखना।

इंजेक्शन के लिए, वायरस मिश्रण के साथ 20-माइक्रोमीटर टिप के साथ एक बाँझ बेवेल ग्लास पिपेट भरें। फिर मस्तिष्क की सतह को छूने के लिए पिपेट को कम करें, और परत 2/3 इंजेक्शन के लिए अतिरिक्त 200 से 300 माइक्रोमीटर के लिए कम करना जारी रखें। एक इंट्रासेल्युलर माइक्रोइंजेक्शन डिस्पेंस सिस्टम का उपयोग करके, दबाव दो मिनट में 12 से 15 बार सिस्टम को इंजेक्ट करता है।

कपाल खिड़की आरोपण के लिए, कवर ग्लास को खोपड़ी में खोलने के ऊपर रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए संदंश का उपयोग करें कि कांच उद्घाटन पर फ्लश है। खोपड़ी के लिए कांच की खिड़की के किनारों को सील करने के लिए, कांच की सतह की परिधि के चारों ओर साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला जेल लागू करें।

चिपकने वाले जेल पर, गोंद की एक परत लागू करें। फिर डेंटल सीमेंट लिक्विड की एक परत डालें। जब दंत सीमेंट सख्त हो जाता है, तो हेलीकाप्टर प्रकार की हेड प्लेट के केंद्रीय उद्घाटन के चारों ओर गोंद की एक पतली परत लागू करें, और कवर ग्लास पर उपयुक्त आकार की हेलीकॉप्टर प्रकार की हेड प्लेट रखें।

गोंद को सूखने दें। 0.1 मिलीलीटर निशान तक एक 1.5-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में दंत सीमेंट पाउडर जोड़ें। पाउडर में तेजी से इलाज तत्काल चिपकने की सात से आठ बूंदों को मिलाएं, और परिणामी मिश्रण को 19 गेज सुई के साथ एक मिलीलीटर सिरिंज में खींचें जिसे एक बड़ा उद्घाटन बनाने के लिए काटा गया है।

हेलीकाप्टर बार के पार्श्व छेद के माध्यम से पाउडर मिश्रण इंजेक्ट करें जब तक कि यह दोनों तरफ से रिस न जाए। खोपड़ी के लिए सिर की प्लेट को जकड़ने के लिए उजागर खोपड़ी के बाकी हिस्सों में दंत सीमेंट चिपकने वाला मिश्रण लागू करें। माउस को कपड़े में लपेटें, और इसे अपने हेड प्लेट के माध्यम से एयरलिफ्ट किए गए घर के पिंजरे के सिर के निर्धारण हाथ में सुरक्षित करें, फिर घर के पिंजरे को प्रकाश के संपर्क में छोड़ दें।

15 मिनट की आदत के समय के बाद, माउस को घर के पिंजरे से हटा दें। माइक्रोस्कोप के विस्तृत क्षेत्र मोड का उपयोग करते हुए, आसानी से पहचाने जाने योग्य वास्कुलचर के दो से तीन पदों का चयन करें। रक्त वाहिकाओं की छवियों को सहेजें, और मोटर नियंत्रक पर दिखाई देने वाले एक्स और वाई-निर्देशांक रिकॉर्ड करें।

न्यूरॉन्स की सिनैप्टिक संरचनाओं की छवि, और एस्ट्रोसाइट्स में GCaMP6f गतिविधि। प्रतिनिधि विश्लेषण में, कपाल खिड़की की गुणवत्ता का मूल्यांकन डेंड्राइट्स और GCaMP6f-व्यक्त एस्ट्रोसाइट्स के दिनों में दोहराए गए इमेजिंग के साथ किया गया था। एक अच्छी खिड़की में, न्यूरोनल संरचनाएं स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली डेंड्राइटिक स्पाइन के साथ कुरकुरा दिखाई दीं।

इमेजिंग के दूसरे दिन दो नए स्पाइन दिखाई दिए। केवल एक रीढ़ की हड्डी बनी रही और पांचवें दिन दिखाई दे रही थी। कैल्शियम गतिविधि का अध्ययन एस्ट्रोसाइट्स में विभिन्न समय बिंदुओं पर GCaMP6f को व्यक्त करने के लिए किया गया था।

एक लोकोमोशन बाउट के दौरान पूरे सेल को शामिल करने वाली एक वैश्विक घटना देखी गई। इस प्रोटोकॉल के दो महत्वपूर्ण चरण यह हैं कि हड्डी को हटाने से पहले हड्डी को पर्याप्त रूप से पतला करने की आवश्यकता होती है, और उद्घाटन पर कवर ग्लास का उचित प्लेसमेंट होता है। इमेजिंग को व्यवहार विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है, या तो इमेजिंग के दौरान, या पोस्ट-बिहेवियर, जैसे कि एक नया मोटर कौशल सीखना, यह निर्धारित करने के लिए कि न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइट संरचना और फ़ंक्शन को सीखने से कैसे संशोधित किया जाता है।