Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Имплантация краниального окна для повторной визуализации In Vivo у бодрствующих мышей
Chapters
Summary June 22nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь представлен протокол имплантации хронического черепного окна для продольной визуализации клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы.
Transcript
Протокол описывает, как выполнять вирусные инъекции и имплантировать черепное окно для визуализации клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы. Преимущество этого метода заключается в том, что структура и активность нейронов и астроцитов могут быть изображены многократно в течение нескольких сеансов. Этот подход может быть использован для определения того, как нейронные клетки изменяются в моделях нейроразвития или нейродегенеративных расстройств, или нарушается ли зависимая от опыта пластичность.
Начните с крепления анестезированной мыши к стереотаксической рамке с помощью зажима морды и ушных вкладышей. Используя стерильные хирургические инструменты, вырежьте и удалите кожу от лобных швов перед брегмой до задней части до лямбды. Используя стерильный хирургический клинок из углеродистой стали 11, аккуратно соскоблите всю соединительную ткань с черепа.
С помощью бормашины постепенно сверлите кость черепа вдоль контура отверстия концентрическими кругами, чтобы облегчить равномерное истончение кости. После каждого концентрического прохода добавляйте каплю или две соляного раствора в пробуренную область и дайте солю в течение не менее 10 секунд, прежде чем возобновить бурение. Осторожно надавите на центральную область кости черепа тонкими щипцами, чтобы проверить, что череп достаточно истончен и двигается.
Убедитесь, что подлежащая сосудистая система, в которой произошло сверление, неповреждена, и что кость не треснула. Осторожно вставьте миниатюрное 15-градусное заостренное лезвие в истонченную кость и вырежьте и используйте гелевую пену, смоченную в физиологическом растворе, чтобы остановить любые кровотечения, которые могут возникнуть. Используя щипцы, осторожно поднимите и удалите кость, заботясь о том, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку.
Для инъекции наполните стерильную скошенную стеклянную пипетку 20-микрометровым наконечником с вирусной смесью. Затем опустите пипетку, чтобы коснуться поверхности мозга, и продолжайте опускаться в течение дополнительных 200-300 микрометров для инъекций слоя 2/3. Используя внутриклеточную систему дозирования микроинъекций, давление вводится в систему от 12 до 15 раз в течение двух минут.
Для имплантации черепного окна поместите покровное стекло над отверстием в черепе. Используйте щипцы, чтобы убедиться, что стекло находится заподлицо над отверстием. Чтобы запечатать края стеклянного окна к черепу, нанесите цианоакрилатный клейкий гель по периметру поверхности стекла.
Поверх клеевого геля нанесите слой клея. Затем добавьте слой зубного цемента в жидкость. Когда зубной цемент затвердеет, нанесите тонкий слой клея вокруг центрального отверстия головной пластины вертолетного типа и поместите пластину головки вертолетного типа соответствующего размера над покровным стеклом.
Дайте клею высохнуть. Добавьте порошок зубного цемента в 1,5-миллилитровую микрофьюжную трубку до отметки 0,1 миллилитра. Смешайте семь-восемь капель быстро отверждающегося мгновенного клея в порошок и втяните полученную смесь в шприц длиной в один миллилитр с помощью иглы 19 калибра, которая была разрезана для создания большего отверстия.
Впрыскивайте порошковую смесь через боковые отверстия вертолетного стержня до тех пор, пока она не просочится с обеих сторон. Нанесите клеевую смесь зубного цемента на остальную часть открытого черепа, чтобы закрепить головную пластину к черепу. Заверните мышь в ткань и закрепите ее через головную пластину к рычагу фиксации головы поднятой по воздуху домашней клетки, а затем оставьте домашнюю клетку подверженной воздействию света.
После 15 минут привыкания выньте мышь из домашней клетки. Используя широкоугольный режим микроскопа, выберите два-три положения легко идентифицируемой сосудистой системы. Сохраните изображения кровеносных сосудов и запишите координаты x и y, которые появляются на контроллере двигателя.
Изображение синаптических структур нейронов и активности GCaMP6f в астроцитах. В репрезентативном анализе качество черепного окна оценивали с помощью повторной визуализации дендритов и GCaMP6f-экспрессирующих астроцитов в течение нескольких дней. В хорошем окне нейронные структуры казались четкими с хорошо видимыми дендритными шипами.
Два новых шипа появились на второй день визуализации. Только один позвоночник сохранялся и был виден на пятый день. Активность кальция изучали в астроцитах, экспрессирующих GCaMP6f в разные моменты времени.
Глобальное событие, охватывающее всю клетку, было засвидетельствовано во время локомоционного поединка. Двумя критическими шагами этого протокола являются то, что кость должна быть адекватно истончена до удаления кости и правильное размещение покровного стекла над отверстием. Визуализация может быть объединена с поведенческим анализом, либо во время визуализации, либо после поведения, таким как изучение нового двигательного навыка, чтобы определить, как нейронная и астроцитарная структура и функция модулируются обучением.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
