Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Implantation av ett kranialfönster för upprepad in vivo-avbildning hos vakna möss
Chapters
Summary June 22nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenteras ett protokoll för implantation av ett kroniskt kranialfönster för längsgående avbildning av hjärnceller hos vakna, huvudhållna möss.
Transcript
Protokollet beskriver hur man utför virala injektioner och implanterar ett kranialfönster för avbildning av hjärnceller i vakna, huvudhållna möss. Fördelen med denna metod är att struktur och aktivitet hos neuroner och astrocyter kan avbildas upprepade gånger under flera sessioner. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma hur neurala celler förändras i modeller av neurodevelopmental eller neurodegenerativa störningar, eller om erfarenhetsberoende plasticitet försämras.
Börja med att fästa en sövd mus i en stereotaxisk ram med hjälp av snutklämman och öronstängerna. Skär och ta bort huden från de främre suturerna främre till bregma till bakre till lambda med hjälp av sterila kirurgiska verktyg. Skrapa försiktigt all bindväv från skallen med ett sterilt storlek 11 kolstål kirurgiskt blad.
Med hjälp av en tandborr borrar du gradvis skallbenet längs öppningens kontur i koncentriska cirklar för att underlätta jämn gallring av benet. Efter varje koncentriskt pass, tillsätt en droppe eller två saltlösning till det borrade området och låt saltlösningen sitta i minst 10 sekunder innan du återupptar borrningen. Tryck försiktigt på det centrala området av skallbenet med fina pincett för att kontrollera att skallen är tillräckligt tunn och rör sig.
Se till att den underliggande vaskulaturen där borrningen inträffade är intakt och att benet inte är knäckt. Sätt försiktigt in ett miniatyr 15-graders spetsigt blad i det tunna benet och skär och använd gelskummet som blötläggs i saltlösning för att stoppa blödningar som kan uppstå. Använd pincett, lyft försiktigt och ta bort benet, var försiktig så att dura mater inte skadas.
För injektionen fyller du en steril fasad glaspipett med en 20-mikrometer spets med virusblandningen. Sänk sedan pipetten för att röra vid hjärnans yta och fortsätt att sänka i ytterligare 200 till 300 mikrometer för lager 2/3 injektioner. Med hjälp av ett intracellulärt mikroinjektionsdispenseringssystem injicerar trycket systemet 12 till 15 gånger under två minuter.
För kranialfönsterimplantation, placera täckglaset över öppningen i skallen. Använd pincett för att säkerställa att glaset är jämnt över öppningen. För att täta glasfönstrets kanter till skallen, applicera cyanoakrylathäftande gel runt glasytans omkrets.
Applicera ett lager lim över limgelen. Tillsätt sedan ett lager tandcementvätska. När tandcement härdar, applicera ett tunt lager lim runt den centrala öppningen på helikoptertyps huvudplattan och placera helikoptertypshuvudplattan av lämplig storlek över täckglaset.
Låt limet torka. Tillsätt tandcementpulver i ett 1,5 ml mikrofugerör upp till 0,1 ml märke. Blanda sju till åtta droppar snabbhärdande snabblim i pulvret och dra den resulterande blandningen i en en milliliter spruta med en 19 gauge nål som har skurits för att skapa en större öppning.
Injicera pulverblandningen genom helikopterstångens sidohål tills den sipprar från vardera sidan. Applicera tandcementlimblandningen på resten av den exponerade skallen för att fästa huvudplattan på skallen. Vik in musen i tyg och fäst den via huvudplattan till huvudfixeringsarmen på den luftlyfta hemburen och lämna sedan hemburen utsatt för ljus.
Efter en tillvänjningstid på 15 minuter, ta bort musen från hemburet. Använd mikroskopets breda fältläge och välj två till tre positioner med lätt identifierbar vaskulatur. Spara bilderna av blodkärlen och spela in x- och y-koordinaterna som visas på motorstyrenheten.
Avbilda de synaptiska strukturerna hos neuroner och GCaMP6f-aktivitet i astrocyter. I den representativa analysen utvärderades kranialfönstrets kvalitet med upprepad avbildning av dendriter och GCaMP6f-uttryckande astrocyter under dagar. I ett bra fönster verkade de neuronala strukturerna skarpa med tydligt synliga dendritiska spines.
Två nya taggar dök upp på dag två av bildbehandlingen. Endast en ryggrad kvarstod och var synlig på dag fem. Kalciumaktivitet studerades i astrocyter som uttrycker GCaMP6f vid olika tidpunkter.
En global händelse som omfattade hela cellen bevittnades under en rörelsekamp. De två kritiska stegen i detta protokoll är att benet måste tunnas tillräckligt innan benet avlägsnas och att täckglaset placeras korrekt över öppningen. Avbildning kan kombineras med beteendeanalys, antingen under avbildning eller efter beteende, såsom att lära sig en ny motorisk färdighet, för att bestämma hur neuronal och astrocytstruktur och funktion moduleras genom inlärning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
