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从真核细胞 中快速体内 固定和分离转化复合物
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Summary December 25th, 2021
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我们提出了一种技术，可以快速稳定活酵母和哺乳动物细胞中具有甲醛交联的转化（蛋白质生物合成）复合物。该方法能够解剖瞬态中间体和动态RNA：蛋白质相互作用。交联复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜和质谱分析。
Transcript
工作流程包括在严格控制的环境条件下生长细胞，使用融化的水/冰快速冷却它们，并用预先优化的甲醛浓度和孵育时间固定。然后使用过量的含伯氨基化合物（例如甘氨酸或胰蛋白酶）淬灭固定反应。细胞被收集，洗涤，可以冷冻储存。
固定细胞可以机械或化学裂解，裂解物用于根据其分子大小，沉降特性或亲和力标记物分离核糖体级分。该方法导致可用于免疫辅助纯化和检测的多功能材料，在电子显微镜中富集含有特定因子的复合物。在交联深度封闭、RNA扩增或基于杂交的分析、RNA测序和质谱分析后成为可能。
在600纳米处起始光密度不超过0.05个吸光度单位的轨道振荡器中设置一升酵母培养物，并在30摄氏度下使用蛋白胨和葡萄糖培养基。设置一个具有兼容转子和离心机瓶的制备离心机，用于在4摄氏度下以5000 G沉淀酵母细胞的液体悬浮液。记录生长细胞的光密度。
如果指数增长阶段感兴趣，则在收集时，它必须介于0.6至0.8吸光度单位和600纳米之间。一旦细胞准备就绪，在化学通风橱内设置一个冰柜，里面有一个含有250克干净碎水冰的面包师，并在烟罩内向您展示25毫升胰蛋白酶和新购买的甲醇稳定37%甲醛溶液。将最新的细胞培养物倒入含有冰块的面包师中。
然后加入75毫升37%甲醛，最终浓度为体积2.2%的重量，强烈搅拌混合物，直到冰融化。冰融化后，设置计时器10分钟孵育10分钟后，将培养物转移到预冷的离心瓶中，并通过在4摄氏度，5000 G下离心细胞沉淀5分钟。旋转时，在预冷50毫升管上并保持新鲜制备的含有甘氨酸的缓冲液A，以中和冰上剩余的甲醛。
离心后，将离心管放在冰上，沉淀面与冰接触。将管子带入通风橱，并将上清液丢弃到甲醛废物容器中。使用25毫升条带将旧管中的细胞沉淀重新悬浮在20毫升缓冲液A中，然后转移到50毫升管中。
用缓冲液A将体积组成40毫升，并通过离心4摄氏度，5000 G收集洗涤细胞5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在40毫升缓冲液A中，该缓冲液A不含甘氨酸以除去甘氨酸污染。通过在4摄氏度，5000G下离心5分钟再次沉淀细胞。
用缓冲液A重复洗涤，再洗一次。弃去上清液并将细胞沉淀放在冰上。用沉淀称量管，湿细胞质量应约为每一升细胞培养物一克。
将聚苯乙烯从装有液氮的铝箔衬里的盒子中填充到约三厘米的深度。将50毫升管直立放置在盒子中。通过移液和涡旋10秒将沉淀重新悬浮在550微升缓冲液A 2中。
每微升RNase抑制剂加入10微升40单位，再次涡旋10秒。使用一毫升移液器，将细胞悬浮液滴入含有液氮的50毫升2中。为了准备下一步，在干冰和10毫升不锈钢研磨罐上预冷1.5毫升无核管。
使用干净的无菌刮刀将冷冻的细胞悬浮液滴转移到罐中。将研磨罐浸入液氮中一分钟，确保液相保持在液络部上方。在27赫兹处设置一个冷冻混合磨机，搅拌一分钟。
在混合器研磨机中以27赫兹搅拌密封的研磨罐一分钟。像以前一样在液氮中重新冷却罐子，并进一步摇晃一分钟。将罐子与1.5毫升无核管一起转移到装有干冰的冰盒中。
使用小钢刮刀将填充的研磨结果转移到管中。然后将管子储存在零下80摄氏度。在两个T175烧瓶中，将HEK 293个细胞生长到60%至70%汇合度和Dalbeko的改良鹰培养基和10%胎牛血清，浓度为37度和5%二氧化碳。
在所需固定时间前至少三小时，将 T175 烧瓶的培养基更换为精确 30 毫升预热的完整培养基。用碎水冰准备一个冰箱，并与所需的缓冲液（也是冰）一起保存在通风橱中。为了使细胞快速冷却，请从培养箱中取出T175烧瓶，然后将其正式压在冰上，以确保最大的表面接触。
在化学通风橱内，将烧瓶倾斜到其侧面，以便培养基聚集在与细胞相反的一侧。将168微升37%的甲醛直接移液到混合培养基中。给予终浓度为0.2%甲醛。
立即混合。将烧瓶在冰上孵育10分钟。将培养基倒入适当的废物容器中，通过与细胞相对的烧瓶侧。
使用剥离液，在30毫升不含钙和镁离子的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中移液，并在细胞对面的一侧轻轻地含有50毫摩尔甘氨酸。摇动烧瓶搅拌，将闪光灯放回水平位置，在冰上再孵育10分钟。通过与细胞相反的烧瓶侧倒出溶液，轻轻加入7毫升标准0.25%胰蛋白酶EDTA溶液以分离并重新悬浮细胞。
将烧瓶在室温下孵育五分钟，最多10分钟。垂直定位烧瓶并使用剥离物，通过轻轻洗涤烧瓶壁上的任何剩余物来收集分离的细胞，并将悬浮液转移到设置在冰上的50毫升管中。立即用20毫升完整的培养基补充收集的悬浮液，并通过轻轻翻转管子混合。
通过将管以100G离心5分钟和4摄氏度来沉淀细胞。细胞沉淀必须清晰可见。倒出培养基，轻轻地将沉淀重新悬浮在10毫升的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中，不含甘氨酸。
再次将管在100 G下离心五分钟，并在4摄氏度下倒出洗涤缓冲液，并将沉淀重新悬浮在800微升冰冷的Dalbeko磷酸盐缓冲盐水中，不含甘氨酸，但含有镁和钙离子。将重新悬浮的细胞转移到新的低蛋白结合1.5毫升微量离心管中。将试管在4摄氏度下以100 G离心三分钟。
使用一毫升移液器小心地丢弃上清液。在这个阶段，细胞沉淀可以在零下80摄氏度下冷冻或进入细胞裂解步骤。在生物安全柜中加入300微升基于非离子，非变性洗涤剂的裂解缓冲液和7微升精氨酸酶抑制剂，并使用一毫升吸头移液充分混合。
小心地将25号针头连接到一到三毫升的注射器上，并使用至少七个缓慢向上的进气和快速向下的排气行程大力移液混合物。将注射器和针头丢弃到夏普的箱子中，然后用31号针头和0.3毫升注射器重复该过程。将注射器和针头丢弃到尖锐的垃圾箱中。
将试管以12， 000 G离心五分钟，以四度除去细胞碎片。将上清液转移到新的低蛋白结合1.5毫升微量离心管中。储存细胞碎片并在零下80摄氏度下裂解。
平移复合物对缓冲液的离子组成敏感。省略氯化镁和添加EDTA消除了高沉降性能，虽然氯化钙导致更好的结果峰值，但改善幅度很小。因此，我们选择了缓冲区一。
2.2%的体积重量甲醛很好地保存了多聚体，并且与4%的体积重量相比，甲醛没有降低总收率。在哺乳动物细胞中，使用低得多的甲醛浓度，即0.2%重量体积。由于浓度较高，导致大量的多核糖体物质损失。
向裂解物和所有后续缓冲液中加入15毫摩尔EDTA对来自固定细胞的多体组分表现出明显较小的不稳定作用。这种效应用50毫摩尔EDTA部分复制，材料来自4%固定细胞，抵抗力，展开得更好。葡萄糖消耗引起对酵母最显著和最快速的转化抑制作用之一。
神经添加和局部原因条件诱导的多体分解均略有增加，但明显多微体保留在低添加葡萄糖中。重要的是，来自固定细胞的多体物质显示出饥饿细胞和非饥饿细胞之间的高度区别，这表明甲醛固定适用于保持动态平移过程中的差异。在诸如tacy paysake之类的方法中，去除与完全根茎不能很好地共同沉降的小核糖体亚基可能是另外有见地的，我们采用了两级超速离心，允许分离SSU，LSU，RS，RNase抗重氮酶，DS和高阶多微体，通过固定级分的电子显微镜确认。
与非固定细胞相比，来自固定细胞的材料在沉积最快的核糖体组分中显示出不稳定的eIF4A的存在。使用来自eIF4A tapi菌株的固定材料来捕获和富集含有磁性IDG微珠配合物的eIF4A，我们能够观察到与SSU和RS中的β-肌动蛋白相比，eIF4A的选择性富集，但不包括RNase one拆卸后第二梯度的LSU级分。与其他转化静息方法相比，甲醛作用在细胞膜上的迅速性和交联的不加区分性保证了翻译复合中间体的最大多样性。
我们的发现符合快速甲醛固定的可用性，以稳定高度瞬态的复合物，并证明在细胞对环境变化或应激条件的快速反应情况下的有用性。
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