This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen
Chapters
Summary December 25th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.
Transcript
De workflow bestaat uit het kweken van cellen in strikt gecontroleerde omgevingsomstandigheden, ze snel koelen met behulp van smeltwater / ijs en fixeren met vooraf geoptimaliseerde concentratie formaldehyde en incubatietijd. De fixatiereactie wordt vervolgens geblust met behulp van een teveel aan primaire aminogroepbevattende verbindingen, zoals glycine of tryps. Cellen worden verzameld, gewassen en kunnen bevroren worden opgeslagen.
Vaste cellen kunnen mechanisch of chemisch worden gelyseerd en het lysaat wordt gebruikt voor de scheiding van de ribosomale fracties op basis van hun moleculaire grootte, sedimentatie-eigenschappen of affiniteitsmarkers. De aanpak resulteert in veelzijdig materiaal dat bruikbaar is voor immunoondersteunde zuivering en detectie, verrijking van complexen die specifieke factoren bevatten in elektronenmicroscopie. Na crosslinked deep blocking, RNA amplificatie of hybridisatie gebaseerde analyses, worden RNA sequencing en massaspectrometrie mogelijk.
Zet een gistcultuur van één liter op in een orbitale shaker met een beginnende optische dichtheid van niet meer dan 0,05 absorptie-eenheden op 600 nanometer en gebruik pepton en dextrosemedia bij 30 graden Celsius. Stel een voorbereidende centrifuge in met compatibele rotor- en centrifugeflessen voor het pelleteren van de vloeibare suspensie van gistcellen bij 5000 G bij vier graden Celsius. Houd de optische dichtheid van de groeiende cellen bij.
Het moet tussen 0,6 en 0,8 absorptie-eenheden en 600 nanometer zijn op het moment van verzamelen als de exponentiële groeifase van belang is. Zodra de cellen klaar zijn, zet je een koelbox in de chemische zuurkast met een bakker met 250 gram schoon crushed water ijs en laat je ook 25 milliliter trypsine en vers gekochte methanol gestabiliseerde 37% formaldehyde-oplossing in de kap zien. Giet de ene laatste celkweek in de bakker met daarin het ijs.
Voeg vervolgens 75 milliliter 37% formaldehyde toe aan een eindconcentratie van 2,2% gewicht over volume en roer het mengsel intens totdat het ijs smelt. Zodra het ijs is gesmolten, stelt u een timer in voor 10 minuten Na het broeden gedurende 10 minuten, brengt u de cultuur over in de voorgekoelde centrifugeflessen en pellett u de cellen door centrifugering op vier graden Celsius, 5000 G gedurende vijf minuten. Terwijl de spin is, koel een buis van 50 milliliter voor en bewaar vers bereide buffer A met glycine om eventuele resterende formaldehyde op ijs te neutraliseren.
Plaats na het centrifugeren de centrifugebuizen op ijs met de pelletzijde in contact met het ijs. Breng de buizen in de zuurkast en gooi het supernatant weg in een formaldehyde afvalcontainer. Hang de celkorrel opnieuw uit oude buizen in 20 milliliter buffer A met behulp van een stripette van 25 milliliter en breng over in een buis van 50 milliliter.
Vul het volume aan tot 40 milliliter met buffer A en vang de wascellen op door een centrifugering van vier graden Celsius, 5000 G gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en suspensie de celkorrel opnieuw in buffer A van 40 milliliter, buffer A die geen glycine bevat om glycineverontreiniging te verwijderen. Pellet de cellen opnieuw door centrifugeren bij vier graden Celsius, 5000 G vijf minuten.
Herhaal de wasbeurten met buffer A, nog één keer. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en leg de celkorrel op ijs. Weeg de buis met de pellet, de natte celmassa moet ongeveer één gram per liter celcultuur zijn.
Vul polystyreen uit doos bekleed met aluminiumfolie met vloeibare stikstof tot een diepte van ongeveer drie centimeter. Plaats op 50 milliliter buis rechtop in de doos. Suspensie de pellet opnieuw in 550 microliter buffer A twee door gedurende 10 seconden te pipetteren en vortexen.
Voeg 10 microliter van 40 eenheden per microliter RNase-remmer toe en vortex opnieuw gedurende 10 seconden. Druppel met behulp van een pipet van één milliliter de celsuspensie in de 50 milliliter twee die de vloeibare stikstof bevatten. Om u voor te bereiden op de volgende stap, koelt u 1,5 milliliter kernvrije buizen voor op droogijs en 10 milliliter roestvrijstalen slijppotten.
Breng de bevroren celsuspendruppels over in de potten met behulp van een schone steriele spatel. Dompel de maalpotten gedurende één minuut onder in vloeibare stikstof, zodat de vloeibare fase boven de junctie blijft. Zet een Cryo-mengmolen op 27 Hertz voor agitatie gedurende één minuut.
Roer de verzegelde maalpotten op 27 Hertz gedurende één minuut in de mengmolen. Koel de potten opnieuw af in vloeibare stikstof zoals voorheen en schud nog een minuut verder. Breng de potten over naar de ijsdoos met droogijs samen met de 1,5 milliliter kernvrije buizen.
Met behulp van een kleine stalen spatel worden de resultaten in gewatteerde maaldatum in de buizen overgebracht. Bewaar de buisjes vervolgens bij min 80 graden. In twee T175 Kolven groeien HEK 293 cellen tot 60 tot 70% confluentie en Dalbeko's gemodificeerd Eagle medium en 10% foetaal runderserum bij 37 graden en 5% koolstofdioxide.
Vervang ten minste drie uur vóór de gewenste fixatietijd de media van de T175-kolf door precies 30 milliliter voorverwarmde complete media. Bereid een ijskast tot de rand voor met gemalen waterijs en bewaar in de zuurkast samen met de vereiste buffers, ook een ijs. Om de cellen te koelen, verwijdert u de T175-kolf uit de incubator en drukt u deze formeel tegen het ijs om maximaal contact met het oppervlak te garanderen.
Kantel in een chemische zuurkast de kolf op zijn kant zodat de media zich verzamelen aan de kant tegenover de cellen. Pipetteer 168 microliter van 37 volumeprocent formaldehyde rechtstreeks in de gepoolde media. Dit geeft een eindconcentratie van 0,2% formaldehyde.
Meteen mengen. Incubeer de kolven verder nog 10 minuten op ijs. Giet de media af in een geschikte afvalcontainer via de kolfzijde tegenover de cellen.
Pipetteer met behulp van een strippete 30 milliliter Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium- en magnesiumionen en bevat bovendien 50 millimolar glycine zachtjes aan de kant tegenover de cellen. Meng door de kolf te wiegen, breng de flitser terug in horizontale positie en incubeer nog 10 minuten op ijs. Giet de oplossing af via de kolfzijde tegenover de cel en voeg voorzichtig zeven milliliter standaard 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe om de cellen los te maken en opnieuw te laten suspenseren.
Incubeer de kolf bij kamertemperatuur gedurende vijf, maximaal 10 minuten. Plaats de kolf verticaal en gebruik een strippete, verzamel de losgemaakte cellen door voorzichtig de resterende van de kolfwanden te wassen en breng de suspensie over in een buis van 50 milliliter die op ijs is gezet. Vul de verzamelde suspensieoplossing onmiddellijk aan met 20 milliliter complete media en meng door de buis voorzichtig om te draaien.
Pellet de cellen door de buis vijf minuten en vier graden op 100 G te centrifugeren. Celkorrel moet duidelijk zichtbaar zijn. Giet de media af en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in 10 milliliter Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder glycine.
Centrifugeer de buis opnieuw bij 100 G gedurende vijf minuten en bij vier graden Celsius Giet de wasbuffer af en suspensie de pellet opnieuw in 800 microliter ijskoude Dalbeko's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder glycine, maar met magnesium- en calciumionen. Breng de opnieuw gesuspendeerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis bij 100 G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.
Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een milliliter pipetter. In dit stadium kan de celkorrel worden ingevroren bij min 80 graden Celsius of doorgaan naar de cellysisstap. Voeg in een bioveiligheidskast 300 microliter lysisbuffer op basis van niet-ionisch, niet-denaturerend wasmiddel en zeven microliter arginaseremmer toe en meng goed door te pipetteren met één milliliterpunt.
Bevestig voorzichtig een naald van 25 gauge aan een spuit van één tot drie milliliter en pipetteer het mengsel krachtig met behulp van ten minste zeven langzame opwaartse inlaat en snelle neerwaartse uitlaatslagen. Gooi de spuit en naald in de bak van de sharp en herhaal de procedure met een naald van 31 gauge en een spuit van 0,3 milliliter. Gooi de spuit en naald in de bak van de sharp.
Centrifugeer de buis bij 12.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden om het celafval te verwijderen. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 milliliter. Bewaar zowel het celafval als lysaat bij min 80 graden celsius.
Translationele complexen zijn gevoelig voor de ionische samenstelling van de buffers. Omittance van magnesiumchloride en toevoeging van EDTA trokken hoge sedimentatie-eigenschappen af, en hoewel calciumchloride resulteerde in betere resultaatpieken, was de verbetering marginaal. We kozen dus voor buffer één.
2,2% volumegewicht formaldehyde heeft de polysomen uitstekend geconserveerd en heeft de totale opbrengst niet verlaagd in vergelijking met 4% volumegewicht formaldehyde. In zoogdiercellen werd een veel lagere concentratie formaldehyde van 0,2 volumeprocent gebruikt. Hogere concentraties resulteerden in aanzienlijk polyribosomaal materiaalverlies.
15 millimolaire EDTA toegevoegd aan het lysaat en alle daaropvolgende buffers vertoonden een duidelijk minder destabiliserend effect op de polysomale fracties, afgeleid van de vaste cellen. En dit effect werd gedeeltelijk gerepliceerd met 50 millimolaire EDTA met materiaal van 4% vaste cellen, weerstand biedend, zich beter ontvouwend. Glucose-uitputting veroorzaakt een van de meest dramatische en snelle translationele remmende effecten op gist.
Zowel zenuw toegevoegd als lokaal veroorzaakte omstandigheden geïnduceerde polysoom demontage was licht, maar blijkbaar meer polysomen vastgehouden in lage toegevoegde glucose. Belangrijk is dat polysomaal materiaal uit de vaste cellen een hoog onderscheid laat zien tussen de uitgehongerde en niet-uitgehongerde cellen, wat wijst op de geschiktheid van formaldehydefixatie om verschillen in dynamische translatieprocessen te behouden. In benaderingen zoals tacy paysake kan het extra inzichtelijk zijn om kleine ribosomale subeenheden te verwijderen die niet goed samenvallen met de volledige wortelstokken waarvoor we een tweetraps ultracentrifugatie hebben gebruikt, waardoor de isolatie van SSU, LSU, RS, RNase-resistente diazomen, DS en hoge orde polysomen bevestigd door elektronenmicroscopie van de vaste fracties mogelijk is.
Vergeleken met de niet-vaste cellen vertoonde materiaal uit de vaste cellen een verhoogde aanwezigheid van labiele eIF4A in de snelst sedimenterende ribosomale fracties. Met behulp van vast materiaal van de eIF4A tapi-stam om eIF4A-bevattende complexen met magnetische IDG-kralen te vangen en te verrijken, konden we selectieve verrijking van de eIF4A waarnemen in vergelijking met bèta-actine in SSU en RS, maar niet LSU-fracties van de tweede gradiënt op RNase één demontage. Vergeleken met andere methoden van translationele rust, belooft de snelheid van formaldehyde-actie over celmembranen en de willekeurige aard van dwarsverbindingen het behoud van de maximale diversiteit van vertaalcomplextussenproducten.
Onze bevindingen voldoen aan de bruikbaarheid van snelle formaldehydefixatie om zeer voorbijgaande complexen te stabiliseren en bewijzen het nut ervan in de scenario's van snelle cellulaire reacties op omgevingsveranderingen of stressomstandigheden.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
