Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol för cellcykelprogressionsanalys i Drosophila neurala stamceller
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Cellcykel analys med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) och phospho-histon H3 (pH3) märkning är en flera steg förfarande som kan kräva omfattande optimering. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver alla steg för denna procedur inklusive bildanalys och kvantifiering för att skilja celler i olika cellcykelfaser.
Transcript
I det här protokollet ger vi inte bara en detaljerad förklaring av varje steg i EDU-inkorporering och immunstaining, utan förklarar också bildförvärv, bildbehandling och ger några tips för att analysera stora datamängder. Denna teknik möjliggör allokering av celler i G1-, S- och M-faser. Detta kommer att vara särskilt användbart för cellcykelanalys av studier på icke-mutationer som påverkar mitotiska gener.
Vi förväntar oss att människor kämpar i två till tre månader om de inte har förkunskaper eller erfarenhet av denna teknik. Till att börja med, lägg till Schneiders dissekeringsmedium eller SM till två på varandra följande fördjupningar av en glansfläckplatta och lägg till PBS till den efterföljande depressionen. Använd ett par tångar, plocka vandrande tredje instar larver och placera dem på en vävnad som är skramlad med PBS för att rengöra flugmatsrester.
Placera larven i depressionen med PBS följt av den på varandra följande depressionen som innehåller SM. Använd sedan under ett dissekeringsmikroskop för att ta bort tre fjärdedelar av larvens underkropp. Ta sedan försiktigt tag i larvens munkrokar med ett par tångar och håll nagelbandet i den andra änden med det andra paret tång. Vänd larvhuvudet ut och in genom att trycka munkrokarna inåt och samtidigt skala av vävnaden i andra änden.
Observera larvhjärnan med bifogade imaginala skivor. Ta bort andra vävnader som är fästa vid hjärnan och överför hjärnan till efterföljande efterföljande depression med SM. Tillsätt 100 mikroliter av 100 mikromolar EDU SM-lösning till en annan depression på Pyrex-plattan och inkubera cirka 5 till 10 dissekerade hjärnor i denna lösning i 2 timmar vid 25 grader Celsius. Efter fixering och immunstaining ta bort PBST och tillsätt EDU detektion cocktail till de dissekerade hjärnorna.
Inkubera dem sedan vid rumstemperatur i mörkret på en neutater. Tvätta proverna två gånger med PBST i 10 minuter per tvätt i mörker efter 30 minuter. För DNA-färgning, förbered 5 mikrogram per milliliter Hoechst 33342-lösning.
Ta bort PBST efter den andra tvätten och tillsätt 500 mikroliter av Hoechst-lösningen till de dissekerade hjärnorna och inkubera dem sedan i mörkret. Efter 10 minuter, ta bort Hoechst och tvätta proverna med PBST i 10 minuter. Knacka på röret på labbbänken och låt hjärnan slå sig ner.
Ta bort PBST från röret och lämna efter dig 50 till 100 mikroliter. Skär änden av en 200 mikroliter mikropipetspets och använd den för att överföra hjärnan till en ren glasrutschbana. Ta bort åtkomst PBST från bilden genom att blotta den med filterpappersremsor.
Låt inte filterpapperet vidröra hjärnan. Sätt en droppe vattenlösligt, icke fluorescerande monteringsmedium på hjärnan och orientera hjärnan så att ventrala nervsladden vetter mot rutschkanan och loberna är vända uppåt. Ordna hjärnan i en enda fil så att det är lättare att avbilda hjärnan seriellt.
Placera försiktigt en täcklapp ovanpå hjärnan och inkubera glidningen över natten vid 2 till 6 grader Celsius. Välj 63 gånger målet från anskaffningsprogramvaran. Lägg en droppe nedsänkningsolja på täckslipen precis ovanför de monterade hjärnorna för att göra det lättare att hitta vävnaden genom okularet.
Använd dappy Hoechst 33342-kanalen, hitta hjärnan genom okularet och byt sedan till förvärvsläget i programvaran. Ställ in 4 kanaler för att avbilda Hoechst 33342, Alexa våning 4 8 8, Alexa våning 5 6, 8 och Alexa golv 6 4 7. Använd färgassistentverktyget för att automatiskt ställa in de valda färgämnenas excitationslasrar och emissionsfilter.
Ställ in synfältet, så att det omfattar hela hjärnloben. Föreställ dig hela volymen av hjärnloben genom att förvärva denna skatt med 0,8 mikron ifrån varandra. Lagra alla bilder från en bildsession i ett dot L I F-biblioteksformat.
För bildanalys öppnar du Fiji och drar och släpper LIF-filerna till Fiji. Välj datawebbläsare på stackvisningsfliken och använd virtuell stack från fliken minneshantering i plugin-programmet för bioformat. Observera bilden med flera kanaler som visas i bild J.Ändra färgen på kanalerna från menyraden med hjälp av verktyget bild, färg och kanaler.
Och övervaka Miranda-märkta neuroblaster, som visas som stora runda celler i den centrala hjärnregionen. Rita en region av intresse med hjälp av ellipsverktyget över varje neuroblast för att undvika att räkna neuroblast två gånger. Välj analys, verktyg och ROI-chef i menyraden bild J.
Markera alla neuroblaster i det aktuella Z-avsnittet och tryck på T efter att ha markerat varje cell. När alla neuroblaster i det nuvarande Z-sektionen är markerade, ändra kanalerna till pH3 och EDU och räkna manuellt antalet EDU positiva neuroblaster, pH3 positiva neuroblaster, EDU och pH3 positiva neuroblaster, och neuroblaster inte färga för någon av markörer. Sök efter neuroblaster och efterföljande Z-sektioner, ta bort gamla ROM och lägg till nya ROM för att räkna neuroblaster i olika staplar.
Förbered ett kalkylblad och beräkna procentandelar av neuroblaster som finns i alla fyra kategorierna för varje lob. Förbered ett stapeldiagram med hjälp av kalkylbladsprogramvaran som visar pooldata för procentandelar neuroblaster i varje kategori. Centrala hjärnneuroblaster från tredje instar larval hjärnor markerade med Miranda, EDU, och pH3 visas här.
Cellerna tilldelades G1/G0-, S-, SG2/M- och M-faserna. I EDU pH3 analys, en betydligt högre andel av MMS19, förlust av funktion neuroblaster hittades i M-fasen jämfört med vilda typ neuroblaster. MMS19:eGFP-uttryck i MMS19 förlust av funktion bakgrund räddade andelen celler i M fas till vilda typ nivåer.
Det är viktigt att inte använda skadade hjärnor för efterföljande steg. Och ED-lösningen bör beredas nyligen innan dissekeringar påbörjas. Denna tillgång kan användas som en snabb inledande screening för att identifiera defekter i specifika cellcykelfaser.
Detta skulle sedan kunna följas upp av en mer detaljerad analys av en viss fas.
Tags
Biologi nummer 171Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
