Immunology and Infection
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प्रवाह Cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं का अलगाव
Chapters
Summary October 14th, 2021
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यह गर्भाशय लिम्फोइड कोशिकाओं को गर्भवती और गैर-गर्भवती चूहों दोनों से अलग करने की एक विधि है। इस विधि का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे कि FACS phenotyping, सेल सॉर्टिंग, कार्यात्मक assays, RNA-seq, और proteomics के लिए किया जा सकता है। यहां प्रोटोकॉल दर्शाता है कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा समूह 1 गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को फेनोटाइप कैसे किया जाए।
Transcript
हमारी विधि गर्भवती और गैर-गर्भवती जानवरों के गर्भाशय के ऊतकों में मौजूद विभिन्न लिम्फोसाइट्स उप-आबादी की संरचना और कार्यात्मक विशेषताओं के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन, सेल व्यवहार्यता और कार्यक्षमता की सतह अभिव्यक्ति को संरक्षित करते हुए गर्भाशय लिम्फोसाइटों के अलगाव की अनुमति देता है। इसलिए यह बाद के अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए उपयुक्त है।
प्रयोग की शुरुआत में भ्रूण को हटाने और ल्यूकोसाइट संग्रह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम हैं। चूंकि यह एक लंबा प्रयोग है, इसलिए एंटीबॉडी धुंधला चरणों तक पहुंचने के बाद विशेष ध्यान और ध्यान देने की आवश्यकता होती है। शुरू करने के लिए, एक गर्भवती C57 काले छह महिला माउस से काटे गए गर्भाशय के ऊतकों को एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, फिर बाँझ उपकरणों का उपयोग करके धीरे से ऊतक के आसपास की वसा को हटा दें, ध्यान रखें कि ऊतक को सूखने न दें।
बाँझ उपकरणों के साथ प्रत्येक आरोपण स्थल को विच्छेदन करके भ्रूण को हटा दें, फिर गर्भाशय को अपने मूल पांच मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में वापस कर दें जिसमें संग्रह मीडिया का एक मिलीलीटर होता है। कैंची का उपयोग करके, संग्रह ट्यूब में ऊतक को कीमा बनाते हैं, फिर ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। इसके बाद ट्यूब के लिए पूर्व गर्म एंजाइमेटिक पाचन मिश्रण के तीन मिलीलीटर जोड़ें।
एंजाइमेटिक पाचन गतिविधि को बढ़ाने के लिए आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, ट्यूब को भंवर करें, और एंजाइमेटिक गतिविधि को बाधित करने के लिए इसे बर्फ पर रखें, फिर पाचन ऊतक को ठीक से लेबल किए गए 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सभी शेष ऊतकों को इकट्ठा करने और इसे 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बर्फ के कुल 10 मिलीलीटर के साथ पांच मिलीलीटर संग्रह ट्यूब को कुल्ला करें।
400 बार G.Discard supernatant पर 10 मिनट के लिए पचे हुए ऊतक के नमूने centrifuge, धीरे से गोली झटका, और फिर पूर्व गर्म पांच millimolar EDTA PBS समाधान के 10 milliliters में resuspended. सेल clumping को कम करने के लिए, आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 10 सेकंड के लिए उच्च पर भंवर करें। असंबद्ध ऊतक में सेल clumps को हटाने के लिए, एक बाँझ 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोमीटर छलनी जगह, फिर एक बाँझ एक मिलीलीटर सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करके, ट्यूब में छलनी के माध्यम से पचने वाले ऊतक को मजबूर करें।
सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ठंडे पीबीएस के कुल 10 मिलीलीटर के साथ छलनी को कई बार धोएं, फिर 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 10 मिनट के लिए 400 बार जी पर खर्च करें सुपरनेटेंट को त्यागने के बाद, जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को या तो विकल्प ए या विकल्प बी का उपयोग करके अलग किया जा सकता है विकल्प ए के लिए, एक पिपेट वीओ का उपयोग करके प्रति कॉल 80% आइसोटोनिक के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। फिर धीमी गति पर पिपेट वीओय का उपयोग करते हुए, ध्यान से आठ मिलीलीटर, 40% प्रति कॉल समाधान, 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पुन: निलंबित गोली पर ओवरले करें। पिपेट धीरे-धीरे और लगातार, 15 मिलीलीटर को लगभग 45 डिग्री के कोण पर पकड़ता है।
ओवरले को परेशान किए बिना, कमरे के तापमान पर मध्यम त्वरण और न्यूनतम ब्रेक के साथ 850 बार जी पर 20 मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। एक बार centrifugation पूरा हो जाने के बाद, प्रति कॉल परतों को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज से ट्यूब को सावधानीपूर्वक हटा दें। प्रति कॉल समाधान दो के इंटरफ़ेस पर ल्यूकोसाइट्स की अंगूठी को परेशान किए बिना, प्रति कॉल परत के शीर्ष के 0.5 से एक मिलीलीटर को छोड़कर सभी को त्यागने के लिए एक बाँझ पास्चर पिपेट का उपयोग करें।
प्रति कॉल समाधान की मात्रा को पिपेट में कम से कम रखने की कोशिश करते समय, ल्यूकोसाइट्स की अंगूठी को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें, और कोशिकाओं को एक नए लेबल वाले 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10% गर्मी और सक्रिय FBS कोशिकाओं के साथ पूरक बाँझ RPMI माध्यम के 10 milliters जोड़ें, फिर 500 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें और लाल रक्त कोशिका lysis के लिए आगे बढ़ें।
विकल्प बी का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करने के लिए, सेल छलनी के माध्यम से पचे हुए ऊतक को पारित करने और सेल निलंबन में परिणाम को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद जैसा कि पहले दिखाया गया था, प्रति कॉल और आरपीएमआई माध्यम 35% आइसोटोनिक के आठ मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। मध्यम त्वरण और न्यूनतम ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 940 बार जी पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर एक aspirator या पिपेट voy का उपयोग करते हुए, 10% गर्मी और सक्रिय FBS के साथ पूरक RPMI माध्यम के 14 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करने से पहले supernatant को सावधानीपूर्वक aspirate करें।
500 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए नमूने को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें, फिर आकांक्षा द्वारा supernatant को त्याग दें और लाल रक्त कोशिका lysis के लिए आगे बढ़ें। लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करने के लिए, एक एक्स लाल रक्त कोशिका लाइसिंग समाधान के तीन मिलीलीटर में नमूने को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए नमूने में पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। supernatant त्यागने के बाद पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर ट्यूब centrifuge, पीबीएस के एक और 10 milliliters जोड़ें और centrofugation दोहराने.
10% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ पूरक RPMI माध्यम के एक मिलीलीटर में गोली resuspend, तो एक बाँझ 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन में पारित. कोशिकाओं की गिनती के बाद पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में एक से 2 मिलियन कोशिकाओं के लिए सेल निलंबन की एकाग्रता को समायोजित करें और धुंधला और फैक्स विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें। गर्भाशय समूह एक आईएलसी में पारंपरिक एनके कोशिकाएं, ऊतक निवासी एनके कोशिकाएं और समूह एक आईएलसी शामिल हैं, जिनके प्रतिशत जीवन और गर्भावस्था के दौरान भिन्न होते हैं।
इन सबसेट को पहले प्रकाश को तितर-बितर करने की क्षमता पर कोशिकाओं को गेटिंग करके प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके भेदभाव किया जा सकता है, फिर एकल खरीदने योग्य सीडी 45 सकारात्मक सीडी तीन नकारात्मक सीडी 19 नकारात्मक कोशिकाओं को अलग करना, और फिर समूह एक आईएलसी की पहचान करना जो एनके 1.1 और एनकेपी 46 सकारात्मक हैं। समूह एक आईएलसी के भीतर, CD49A नकारात्मक ईएम सकारात्मक पारंपरिक एनके कोशिकाएं हैं। CD49A सकारात्मक ईएमएस सकारात्मक कोशिकाएं ऊतक निवासी एनके कोशिकाएं हैं।
और CD49 सकारात्मक ईएमएस नकारात्मक कोशिकाएं समूह एक गर्भाशय आईएलसी हैं। एंटी एनके पी 46 और एंटी एनके 1.1 एंटीबॉडी के साथ प्लीहा और गर्भाशय लिम्फोसाइट्स के धुंधला होने से पता चलता है कि प्लीहा लिम्फोसाइट्स अपने गर्भाशय समकक्ष की तुलना में अपनी सतह पर एनकेपी 46 की उच्च मात्रा में व्यक्त करते हैं। एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण में, सतह के एपिटोप को पाचन माध्यम में उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों के आधार पर बदला जा सकता है।
उदाहरण के लिए, MHC CD49 NKG2A रिसेप्टर के लिए धुंधला खराब है जब liberase TM का उपयोग किया जाता है। हालांकि, लिबरेज़ डीएच के साथ पाचन 1611 एंटीबॉडी क्लोन द्वारा NKG2A मान्यता को संरक्षित करता है। गर्भावस्था के दिन 8.5 पर गर्भाशय के ऊतकों के नमूनों में मौजूद समूह एक आईएलसी का लगभग 6.5% रक्त व्युत्पन्न होता है।
रक्त संदूषकों को एक फ्लोरोक्रोम के साथ संयुग्मित एंटी सीडी 45 एंटीबॉडी के साथ इंट्रावाइटल स्टेनिंग के माध्यम से बाहर रखा जा सकता है। समय की बैठकों के लिए सेट करते समय, आपको यह ध्यान में रखना चाहिए कि चूहे निशाचर हैं। इसलिए उन्हें दोपहर में जितनी देर हो सके स्थापित किया जाना चाहिए क्योंकि संभोग रात के दौरान होगा।
इसके अलावा महिलाओं का चयन करते समय, आपको यह सुनिश्चित करना होगा कि उनके पास योनि सेप्टम नहीं है। हम आमतौर पर कोशिकाओं के बाहर और कोशिकाओं के भीतर कई प्रोटीनों को देखने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करते हैं। हम जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण भी करते हैं, जिसमें आरएनए अनुक्रमण भी शामिल है।
और हम गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कार्यात्मक assays के आसपास का प्रबंधन भी करते हैं।
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