Login processing...

Journal / Chemistry /

JoVE Journal
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Journal (Chemistry)

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO₂ Source

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Journal (Chemistry)

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Click here for the English version

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Article DOI: 10.3791/62672-v • 05:45 min

June 8th, 2021 •

Lingxiao Chaihu^1,2, Xiaopeng Yao¹, Xiang Xu^1,2, Zhongqin Zhu¹, David D. Y. Chen³, Guanbo Wang¹

¹School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, ²Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, ³Department of Chemistry, University of British Columbia

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 8th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.

Transcript

Denne metoden gjør det mulig å skille mellom sameksistensproteinarter, inkludert forskjellige konforme eller varianter og online karakterisering av deres høyere rekkefølgestrukturforskjeller som skal fullføres i en enkelt CEMS-måling. Den benytter den elektroforetiske effekten for å gi et nesten 100% varighetsmiljø for HDX-reaksjonene og ortogonal separasjon av de sameksistenserende proteinartene under HDX for ovenfra og ned MS-analyse. Begynn med prekondisjonering av kapillær elektroforese, hydrogendeuteriumutveksling eller CE HDX-oppsett.

Ved hjelp av ultralydbehandling i en blanding av 50% metanol, 49% vann og 1% maursyre, rengjør strømmen gjennom mikrovial CE-MS-grensesnitt i minst 30 minutter ved romtemperatur. Monter den HPC-modifiserte kapillæren på kapillærelektroferesen eller CE-instrumentet. Skyll kapillæren med bakgrunnselektrolyttoppløsning eller BGE i 10 minutter ved hjelp av den automatiske prøvetakeren og la den være fylt med BGE.

Bruk en passende lengde på umodifisert smeltet silika kapillærrør som infusjonsrør for modifikatoroppløsningen. Bruk en kobling og riktig hylse for å koble modifikatorslangen til en gasstett glasssprøyte med en stump temperatur og skyll slangen med modifikatoroppløsningen i minst 10 minutter ved hjelp av en infusjonspumpe. Sett inn uttakene til HPC-kodet CE-kapillær- og modifikatorrør lastet med de tilsvarende løsningene i det rensede CE-MS-grensesnittet.

Før sprøyten med infusjonspumpene slik at modifikatoroppløsningen når spissen av grensesnittet. Monter det monterte CE-MS-grensesnittet på et nanoelektronsprayioniseringskildehus av et massespektrometer. Påfør en sprayspenning på 3-5 kilovolt på CE-MS-grensesnittet.

Tilsett modifikatorløsningen med infuserpumpen med en strømningshastighet fra 0,1-10 mikroliter per minutt og sørg for en stabil elektrospray på spissen av CE-MS-grensesnittet. Plasser prøvehette hetteglasset som inneholder BGE og den automatiske prøvetakeren, som senere vil bli brukt til å skaffe seg tomme elektroferogrammer og blank massespektra. Beregn injeksjonsvolumet ved hjelp av forholdet mellom injeksjonsvolum og injeksjonsparametere.

Og injiser prøveløsningen ved hjelp av den automatiske prøven ved to PSI for en passende varighet. Start CE-separasjonen ved å påføre en elektroforetisk spenning på 20 kilovolt i et infusjonstrykk fra 0-2 PSI og skaffe elektrofarmogrammet. I mellomtiden skaffer du MS-dataene i kromatografisk modus der ionstrømsgrafen er anskaffet som en funksjon av tid, og de tilsvarende MS-skanningene kombineres ikke automatisk til et enkelt spektrum.

Lagre det tomme elektropherogrammet og massespektraet som referanser. Plasser prøvehettene som inneholder de ønskede konsentrasjonene av proteinprøveløsningene i autoprøven og skaff elektroferogrammer og MS1-spektra av de elektroforetisk separerte og deuteriummerkede proteinartene. Utfør tandem Ms.measurements for arten av interesse, enten etter å ha anskaffet MS1-spektra i samme løp eller i et påfølgende separat løp.

Etter hver måling, skyll kapillæren med BGE med et trykk på 20 PSI i minst 10 minutter. Rengjør CEMS-grensesnittet og all rør for lagring når eksperimentene er fullført. Hent et datasett for HDX-endepunktprøven med MS i direkte infusjonsmodus.

Et lavt infusjonstrykk resulterte i bedre separasjon av CE-topper, men førte til en økning i både migrasjonstiden og varigheten av eksperimentet. En lengre HDX-reaksjonstid resulterte i et høyere nivå av dedurasjon av proteinanalyttene. A- og B-variansen av betaimmunoglobulin eller beta-IG, som varierer med bare to aminosyrerester i sekvensen, ga opphav til to tilstrekkelig separerte topper i EIC-avledet elektroferogram.

Differensialdeuteriet merket varians resulterte i en tydelig massefordeling av ioner. Et lavere antall i relativ overflod av Z-ioner enn C-ioner ble observert på grunn av den unike dysofierte koblingen i bekreftelse av beta-IG som begrenser fragmenteringseffektiviteten mellom CS 82 og CS 176. De fleste fragmentionene produsert fra beta IGA, og beta IGB viser en lignende grad av deuteriumopptak.

De større segmentene som dekker sekvensvariasjonsstedene fra beta-IGA, ble imidlertid utledet i betydelig større grad enn beta-IGB. PH for BGE justeres i henhold til det isoelektriske punktet i prøven for å forhindre proteinaggregering og lette separasjon samtidig som komplekset opprettholdes.

X

Simple Hit Counter