Chemistry
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Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo
Chapters
Summary June 8th, 2021
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Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.
Transcript
Este método permite completar la separación de especies proteicas coexistentes, incluidos diferentes conformadores o variantes y la caracterización en línea de sus diferencias de estructura de orden superior en una sola medición CEMS. Utiliza el efecto electroforético para proporcionar un entorno de casi el 100% de duración para las reacciones HDX y la separación ortogonal de las especies de proteínas coexistentes durante HDX para el análisis de EM de arriba hacia abajo. Comience con el preacondicionamiento de la electroforesis capilar, el intercambio de hidrógeno deuterio o la configuración ce HDX.
Usando ultrasonido en una mezcla de 50% de metanol, 49% de agua y 1% de ácido fórmico, limpie el flujo a través de la interfaz microvial CE-MS durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Monte el capilar modificado HPC en la electroféresis capilar o instrumento CE. Enjuague el capilar con solución de electrolito de fondo o BGE durante 10 minutos con el muestreador automático y déjelo lleno con el BGE.
Utilice una longitud adecuada de tubo capilar de sílice fundida sin modificar como tubo de infusión para la solución modificadora. Use una unión y una funda adecuada para conectar el tubo modificador a una jeringa de vidrio hermético al gas con una temperatura roma y enjuague el tubo con la solución modificadora durante al menos 10 minutos con una bomba de infusión. Inserte las salidas de los tubos capilares y modificadores CE codificados HPC cargados con las soluciones correspondientes en la interfaz CE-MS limpia.
Avance la jeringa con las bombas de infusión de tal manera que la solución modificadora llegue a la punta de la interfaz. Monte la interfaz CE-MS ensamblada en una carcasa de fuente de ionización por pulverización de nano electrones de un espectrómetro de masas. Aplique un voltaje de pulverización de 3-5 kilovoltios a la interfaz CE-MS.
Infundir la solución modificadora con la bomba del infusor a un caudal que oscila entre 0,1 y 10 microlitros por minuto y garantizar una electropulsión estable en la punta de la interfaz CE-MS. Coloque el vial de muestra que contiene el BGE y el muestreador automático, que se utilizará más tarde para adquirir electroferogramas en blanco y espectros de masas en blanco. Estimar el volumen de inyección utilizando la relación entre el volumen de inyección y los parámetros de inyección.
E inyecte la solución de muestra utilizando el muestreador automático a dos PSI durante un período adecuado. Iniciar la separación CE aplicando una tensión electroforética de 20 kilovoltios en una presión de infusión que oscila entre 0-2 PSI y adquirir el electroferograma. Mientras tanto, adquiera los datos de MS en el modo cromatográfico donde el gráfico de corriente iónica se adquiere en función del tiempo y los escaneos MS correspondientes no se combinan automáticamente en un solo espectro.
Guarde el electroferograma en blanco y los espectros de masas como referencias. Coloque los viales de muestra que contienen las concentraciones deseadas de las soluciones de muestra de proteínas en el automuestreador y adquiera los electroferogramas y espectros MS1 de las especies de proteínas separadas electroforéticamente y marcadas con deuterio. Realizar mediciones en tándem de Ms. para las especies de interés, ya sea después de adquirir los espectros MS1 dentro de la misma ejecución o en una ejecución separada posterior.
Después de cada medición, enjuague el capilar con BGE a una presión de 20 PSI durante al menos 10 minutos. Limpie la interfaz CEMS y todos los tubos para el almacenamiento una vez finalizados los experimentos. Adquiera un conjunto de datos de la muestra de punto final HDX con MS en modo de infusión directa.
Una baja presión de infusión resultó en una mejor separación de los picos de CE, pero condujo a un aumento tanto en el tiempo de migración como en la duración del experimento. Un tiempo de reacción HDX más largo resultó en un mayor nivel de deduración de los analitos de proteínas. La varianza A y B de la inmunoglobulina beta o beta IG, que difieren por solo dos residuos de aminoácidos en su secuencia, dio lugar a dos picos adecuadamente separados en el electroferograma derivado de EIC.
La varianza diferencial marcada con deuterio resultó en una distribución de masa distinta de iones. Se observó un número menor en abundancia relativa de iones Z que de iones C debido al enlace disofificado único en la confirmación de beta IG que limita la eficiencia de fragmentación entre CS 82 y CS 176. La mayoría de los iones fragmentos producidos a partir de beta IGA y beta IGB exhiben un grado similar de absorción de deuterio.
Sin embargo, los segmentos más grandes que cubren los sitios de variación de secuencia de beta IGA se dedutraron en una medida significativamente mayor que beta IGB. El pH de BGE se ajusta de acuerdo con el punto isoeléctrico de la muestra para evitar la agregación de proteínas y facilitar la separación mientras se mantiene el complejo.
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