Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tillväxt, rening och titrering av onkolytisk herpes simplex virus
Chapters
Summary May 13th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I detta manuskript beskriver vi en enkel metod för tillväxt, rening och titrering av onkolytiska herpes simplex virus för preklinisk användning.
Transcript
Onkolytisk herpes simplex virus är en framväxande form av cancer immunterapi. Ett effektivt system för virusförökning, rening och titerisk bestämning är avgörande för användningen i experimentella studier. Denna metod är mycket enkel och kan enkelt antas i alla biosäkerhetsnivå två laboratorieinställning för att få ett högkvalitativt viruslager för prekliniska studier.
Produktion av ett högkvalitativt, rent viruslager är avgörande eftersom det används för att studera immunsvar mot cancer och för att utveckla en ny form av virusbaserad cancerimmunterapi. Detta protokoll kan användas för att rena alla vilda eller genetiskt konstruerade herpes simplex virus. Detta protokoll ska vara lättläst och lätt att följa för en individ som aldrig har utfört denna teknik tidigare.
De listade materialen och reagenserna bör vara på plats innan du provar denna teknik för första gången. Börja med att tvätta T-150 kvadratcentimeterkolvarna med två gånger hög glukos DPBS kompletterad med 1%IFCS. Aspirera DPBS och tillsätt sju milliliter virusinokulat per kolv.
Vagga försiktigt flaskorna i fem minuter och inkubera vid 37 grader Celsius i 1,5 till 2 timmar. Ta sedan bort inokulatet och tillsätt 25 milliliter DMEM kompletterat med 1%IFCS till varje kolv. Efter inkubation vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i två till fyra dagar, samla 20 milliliter av kulturens supernatant från varje kolv i 50 milliliter centrifugerör.
Skrapa cellerna från kolvernas botten med hjälp av en cellskrapa. Tillsätt cirka 15 milliliter av den tidigare insamlade odlingssprickan till varje kolv för att få volymen upp till 20 milliliter och använd sedan en steril serologisk pipett på 10 milliliter för att försiktigt tvätta kolvernas botten några gånger. Samla cellerna med medium i 50 milliliter koniska centrifugeringsrör placerade på is.
Centrifugera rören vid 300 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Återanvänd varje pellet noggrant i 1,25 milliliter virusbuffert, eller VB, och 1,25 milliliter tidigare insamlad odlingsövernatant. Blanda alla återanvända pellets i ett koniskt centrifugerrör på 50 milliliter.
Snap frys de återanvända cellerna med torr is och 100% etanol och lagra på minus 80 grader Celsius. Tina de tidigare knäppta frusna cellerna i ett varmt vattenbad vid 37 grader Celsius och ultraljudssyra i en minut i tre cykler i ett vattenbad. Tillsätt 175 enheter Benzonase Nuclease och två mikroliter av två millimolär magnesiumklorid per milliliter av celllysat och virvel.
Efter en inkubation på 30 minuter och varmt vattenbad vid 37 grader Celsius, placera röret på is. Snurra celllyset vid 300 gånger G i 10 minuter. Samla supernatanten i ett nytt koniskt centrifugerör på 50 milliliter och sätt tillbaka cellpelleten i 500 mikroliter VB. Besn att det är pellets ett.
Snurra den insamlade supernaten igen vid 500 gånger G i 10 minuter och förvara supernaten separat i ett friskt 50 milliliter koniskt centrifugerrör som ska användas senare. Återanvänd cellpelleten i 500 mikroliter VB och beskriv den som pellet två. Kombinera den återanvända pelletsen ett och pellets två i ett nytt 1,75 milliliter centrifugerör och virvel och sonicate två gånger i ett vattenbad innan du snurrar rören vid 400 gånger G i 10 minuter.
Samla supernatanten från 1,7 milliliter centrifugerör och kombinera det med supernaten som tidigare samlats in 50 milliliter koniskt centrifugerrör. Filtrera supernatanten genom ett sterilt PVDF-membranfilter på fem mikrometer till ett nytt 50 milliliter centrifugerör som kallas rör ett. Tillsätt en milliliter VB till centrifugröret på 50 milliliter, tömt efter filtrering av supernaten från föregående steg, virvel, och för det genom samma PVDF-membranfilter som placerats på rör ett.
Skicka filtratet från rör ett genom ett sterilt MCE-membranfilter på 0,8 mikrometer placerat på ett nytt 50 milliliter centrifugerör som kallas rör två. Tillsätt en milliliter VB till det tömda röret ett, virvel, och skicka det genom samma MCE-filter som placeras på rör två. För filtratet från rör två genom ett sterilt PVDF-filter på 0,45 mikrometer placerat på ett nytt 50 milliliter centrifugerör märkt rör tre.
Som beskrivits tidigare, upprepa tvättningen av rör två med en milliliter VB för att lägga till filtrate till rör tre. I denna representativa analys kunde cytopatisk effekt observeras i Vero celler vid 36, 48 och 72 timmar efter oHSV infektion med avrundning av de drabbade cellerna. Den ökande nivån av CPE över tid är uppenbart som visualiseras av mCherry uttryck.
Vid 72 timmar efter infektion, virala plack var färgas med X-gal att visualisera oHSVs med lacZ uttryck. Att försiktigt skrubba bort virusinfekterade celler och försiktigt tvätta botten på kolven är avgörande för att hålla alla HSV-infekterade celler intakta så att ett viruslager med hög titer kan erhållas.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
