Bioengineering
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Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità
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Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.
Transcript
Allungato e polarizzato l'ameloblasto secernente amelogenina in coltura. Questo è anche il primo protocollo per la crescita di cellule ameloblasti in microgravità. La crescita degli ameloblasti in coltura è stata una delle maggiori sfide nel campo dello smalto.
E per noi, è usare questo modello di bioreattore, è la prima volta che abbiamo realizzato questo segno distintivo nella ricerca sullo smalto. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la biologia delle cellule ameloblastiche. Questo modello sarà dimostrato dal Dr.Mirali Pandya.
Inizia posizionando il tessuto raccolto da topi postnatali di sei giorni sotto il microscopio a dissezione e le anse cervicali sezionate. Installare un bioreattore collegando le valvole sterili alle porte della siringa. Aggiungere entrambe le cellule, l'ansa cervicale e la polpa dentale, insieme allo scaffold rivestito al bioreattore e riempire il vaso del bioreattore con 10 millilitri di mezzi SFM di cheratinociti integrati con fattori di crescita e proteine della matrice extracellulare.
Chiudere e stringere il tappo della porta di riempimento del contenitore del bioreattore, quindi aprire le valvole sterili. Utilizzare due siringhe sterili da tre millilitri per un cambio del supporto. Per fare ciò, riempire una siringa con il mezzo fresco e lasciare l'altra siringa vuota.
Aprire entrambe le valvole della siringa e manovrare delicatamente le bolle verso la porta vuota della siringa. Una volta che il mezzo fresco della siringa piena viene accuratamente iniettato nel recipiente, rimuovere tutte le bolle attraverso la porta vuota della siringa. Chiudere le porte della siringa con i tappi.
Attaccare ogni recipiente alla base del rotatore. Accendi l'alimentazione e imposta la velocità su 10,1 rotazioni al minuto. Regolare la velocità per assicurarsi che i ponteggi siano in sospensione e non tocchino la parete della nave.
Per il cambio dei fluidi ogni 24 ore, posizionare i vasi in posizione verticale per assicurarsi che le cellule si depositino sul fondo. Aprire le porte della siringa per collegare le siringhe sterili alle porte. Aspirare il 75% del terreno impoverito di nutrizione e iniettare il mezzo fresco attraverso l'altra porta come dimostrato in precedenza.
Le macrografie dello scaffold al grafene e dello scaffold al collagene sono mostrate qui. L'impalcatura di grafene aveva una serie parallela di goffrature superficiali, mentre l'impalcatura di collagene mostrava la struttura porosa. Una mandibola scheletrizzata di topo è stata sezionata e la parte più distale dell'incisivo inferiore del topo è stata esposta.
La posizione precisa dell'ansa cervicale resecata è delimitata nell'incisivo di topo postnatale di sei giorni, mentre una regione simile in una mandibola di topo scheletrata adulta è fornita come riferimento. Gli emimandibili erano composti da tre molari mandibolari e un incisivo in costante crescita, mentre la nicchia cellulare dell'ansa cervicale conteneva una variegata popolazione cellulare necessaria per la formazione dello smalto. La differenziazione riuscita delle cellule dell'ansa cervicale in un microambiente su misura ha portato alla formazione di ameloblasti con una caratteristica tipica delle cellule polarizzate con il nucleo a un'estremità e lunghi processi cellulari all'altra.
La coltura di cellule in soli mezzi senza fattori di crescita e rivestimento di impalcatura ha portato a cellule dell'ansa cervicale che hanno secreto le proteine chiave dello smalto, ma non si sono allungate o polarizzate. Il gruppo scaffold rivestito di galanina ha dimostrato un tasso di proliferazione significativamente più elevato rispetto al gruppo di controllo contenente scaffold non rivestiti. I segmenti di tessuto polmonare raccolti da topi E15 sono stati coltivati con successo per 10 giorni in un ambiente di microgravità 3D nel bioreattore.
L'aggiunta di interleuchina-6 al terreno di coltura ha determinato cambiamenti associati all'infiammazione nella morfologia alveolare simili a quelli osservati in vivo. Nell'introduzione, ti ho detto quanto sia stato difficile per il team dello smalto elaborare un modello di coltura cellulare di ameloblasti. Ora abbiamo affrontato questa sfida utilizzando una procedura altamente innovativa che si concentra su due aspetti: l'impalcatura di collagene spugnoso e anche l'impiego della matrice per differenziare le cellule ameloblastiche.
Insieme, queste due innovazioni hanno portato alla polarizzazione e alla crescita di cellule simili agli ameloblasti nella coltura 3D. Queste cellule in coltura 3D sono un modello meraviglioso per comprendere la biologia degli ameloblasti. E per capire questa biologia, possiamo usare una varietà di tecniche tra cui microscopia elettronica, proteomica e genomica.
Gli ameloblasti sono cellule fantastiche. Sì, hanno la capacità di secernere lo smalto prismatico dei denti. Ora, questo modello di bioreattore ci mette nella posizione di capire come gli ameloblasti secernono la matrice e secernono minerali di apatite per far crescere lo smalto dei denti prismatici.
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