Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Jedes Neuron im Gehirn ist durch etwa 7.000 Synapsen mit anderen neuronalen Zellen verbunden. Außer, dass sich diese Synapsen im Gehirn von Säugetieren hauptsächlich auf den kleinen Vorsprüngen der Membran befinden, die als dendritische Stacheln bezeichnet werden. Plastizität der Synapsen und dendritischen Stacheln und dergleichen, so wichtige Gehirnfunktionen wie Lern- und Gedächtnisprozesse.

Es ist wichtig zu beachten, dass nur die Elektronenmikroskopie einen vollständigen Einblick gibt, ob eine dendritische Wirbelsäule einen postsynaptischen Eingang hat. Verschiedene Techniken zur Bildgebung der dendritischen Stacheln stehen zur Verfügung. Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie bietet jedoch die einzigartige Möglichkeit, große Gewebemengen mit einer hohen Auflösung abbilden zu können.

Die serielle blockbasierte Rasterelektronenmikroskopie erfordert ein spezielles Protokoll der Probenvorbereitung, das einen starken Kontrast zu Schwermetallen beinhaltet. Meine primäre Fixierung während der Perfusion ermöglichte es uns, die gleichen Gehirne für die aufgehellte Elektronenmikroskopie zu verwenden. Mäuse wurden geopfert und mit einem milden primären Fixiermittel durchtränkt.

Das Gehirn wurde in Zwei hälften geschnitten und eine Hemisphäre wurde mit Immunfluoreszenz-dediziertem Fixiermittel, Kryoprotektivum fixiert, mit einem Kryostaten geschnitten und für Immunfluoreszenzstudien verarbeitet. Wo die andere Hemisphäre mit elektronenmikroskopischem Fixiermittel fixiert, mit dem Vibratom geschnitten und für elektronenmikroskopische Untersuchungen vorbereitet wurde. Gehirnschnitte für serielle blockbasierte Rasterelektronenmikroskopie-Studien wurden kontrastiert, flach in Harz eingebettet, dann wurde eine CA1-Region des Hippocampus am Pin montiert und mit dem seriellen blockbasierten Rasterelektronenmikroskop abgebildet.

Der Teil des Protokolls, der in einem gelben Kasten hervorgehoben ist, wurde im Video gezeigt. Nehmen Sie das Gewebe, das fixiert und in 100 mikrobiotische Scheiben geschnitten wurde, und waschen Sie es mit kaltem Phosphatpuffer fünfmal für jeweils drei Minuten. Bereiten Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 4% Osmiumtetroxid und 3% Kaliumferrocyanid vor.

Das Endprodukt wird braun. Tauchen Sie die Proben in diese Mischung. Dann legen Sie die Proben auf Eis.

Und ab diesem Stadium ist es wichtig, sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie sie mit sanftem Schütteln für eine Stunde. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die TCH-Lösung vor.

Mischen Sie 10 Milliliter doppelt destilliertes Wasser und 0,1 Gramm TCH. Legen Sie es für eine Stunde in einen Ofen, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist. Es ist wichtig, die Lösung von Zeit zu Zeit zu finden.

Wenn Sie fertig sind, kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab. Waschen Sie nun die Proben fünfmal für jeweils drei Minuten mit doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie sie dann in gefilterte TCH-Lösung. Die Scheiben werden schwarz.

Inkubieren Sie sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Proben fünfmal für jeweils drei Minuten mit doppelt destilliertem Wasser und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang mit 2% Osmiumtetroxid, diesmal bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Proben wieder fünfmal für jeweils drei Minuten mit doppelt destilliertem Wasser und legen Sie sie in gefiltertes 1% oder Amylacetat.

Inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie am nächsten Tag mit der Vorbereitung auf D-Aspartat. Mischen Sie Bleinitrat mit Asparaginsäurelösung, die auf 60 Grad Celsius vorgewärmt ist.

Legen Sie die Mischung in ein Wasserbad bei 60 Grad Celsius und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid auf 5,5 ein. Schließen Sie die Durchstechflasche mit Bleiaspartat und lassen Sie sie bei 60 Grad Celsius 30 Minuten stehen. Die Lösung sollte klar sein.

Wenn es bewölkt wird, muss es verworfen werden und ein neues muss vorbereitet werden. In der Zwischenzeit die Proben mit dem Gas doppelt destilliertem Wasser fünfmal für jeweils drei Minuten waschen und 30 Minuten im Ofen bei 60 Grad Celsius aufbewahren. Tauchen Sie die Proben in die frisch zubereitete Bleiaspartatlösung und ubatieren Sie sie 20 Minuten lang im Bei 60 Grad Celsius eingestellten Ofen.

Bereiten Sie Epoxidharz vor. Wiegen Sie die Zutaten und mischen Sie das Harz mindestens 30 Minuten lang gut, bevor Sie den Beschleuniger DMP 30 hinzufügen. Bereiten Sie das Virus mit abgestufter Verdünnung von Ethanol vor.

Dann nehmen Sie die Proben aus dem Ofen und waschen Sie sie erneut mit doppelt destilliertem Wasser fünfmal für jeweils drei Minuten. In der Zwischenzeit mischen Sie das Harz mit 100% Ethanol im Eins-zu-Eins-Verhältnis, um das 50% Harz zu erhalten. Mischen Sie es gut.

Anschließend die Proben in jeder Ethanolverdünnung fünf Minuten lang dehydrieren. Denken Sie daran, dass die Proben niemals vollständig trocknen dürfen. Infiltrieren Sie die Proben zuerst in 50% Harz für 30 Minuten, dann in 100% Harz für eine Stunde und dann wieder in einem frischen 100% Harz über Nacht.

Am nächsten Tag legen Sie die Proben für eine Stunde in frisches 100% Harz und betten sie dann zwischen Fluorpolymer-Einbettungsplatten ein. Bereiten Sie Stücke von Einbettungsplatten vor, die mit Ethanol entfettet wurden, und legen Sie die Glasobjektträger beiseite, die als Träger verwendet werden. Legen Sie ein Stück Einbettfolie auf einen Glasträger, geben Sie einen Tropfen Harz darauf und übertragen Sie die Probe dann vorsichtig mit einem Holzstab.

Bedecken Sie es mit dem zweiten Stück. Versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden. Seien Sie sanft, da das Gewebe sehr zerbrechlich ist.

Legen Sie vorsichtig einen weiteren Glasträger auf das Einbettfolienstück und härten Sie die Probe mindestens 48 Stunden lang bei 70 Grad Celsius im Ofen aus. Trennen Sie die Schichten und schneiden Sie ein Stück der eingebetteten Probe mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie es auf Paraffin.

Dadurch wird die Gefahr minimiert, dass die Probe aufgrund von Elektrostatik verloren geht. Nehmen Sie einen Aluminiumstift, der mit Ethanol entfettet wurde. Mischen Sie ein leitfähiges Epoxidharz gut und verwenden Sie eine kleine Menge davon, um die Probe am Stift zu befestigen.

Härten Sie leitfähiges Epoxidharz bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten aus. Schneiden Sie jede Seite des Probenblocks mit dem Diamantmesser ab und polieren Sie dann die Vorderseite des Blocks, bis das Gewebe freigelegt ist. Die Probe mit leitfähiger Farbe auf den Stift auf den Stift einmahlen und aushärten.

Um das Laden zu minimieren, sollten die Proben auch mit einer dünnen Schicht Gold oder Goldpalladium beschichtet werden. Legen Sie den Stift mit der Probe in die Kammer des seriellen blockbasierten Rasterelektronenmikroskops. Richten Sie die Probe am Messer aus, schließen Sie dann die Kammer und stellen Sie die Parameter ein.

Sammeln Sie einen Stapel Bilder. Mit der beschriebenen Methode wurden Bilder von Maus-Hirngewebe erhalten. Das große Bild des Hippocampus in einer Region wurde aufgenommen und die Bildgebung wurde in der Mitte des Stratum radiatum gesetzt.

Ein Stapel von Bildern wurde aufgenommen und die interessierenden Objekte wie dendritische Stacheln und Synapsen wurden segmentiert. Eine qualitativ hochwertige Gewebemorphologie wurde mit deutlich sichtbaren Membranen und synaptischen Vesikeln und gut erhaltenen Mitochondrien erhalten. Immunfluoreszierende Studien mit PSD 95-Antikörpern bestätigten, dass eine milde primäre Fixierung und eine traditionelle Fixierung mit 4% PFA vergleichbare Ergebnisse liefern.

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Erfassung von Hirngewebebildern mit serieller blockbasierter Rasterelektronenmikroskopie, hochwertiger Gewebemorphologie und 12 sichtbaren Membranen, die 10 rechte Segmentierung und Rekonstruktion ermöglichen. Meine primäre Fixierung ermöglichte es, die gleichen Gehirne für die Analyse der PSD 95-Immunfluoreszenz und elektronenmikroskopische Bildgebung dendritischer Stacheln zu verwenden. Hier verwenden wir PSE 9, 500 Knospen.

Der andere kann jedoch auch verwendet werden.