Hyperaktiv piggyBac Transposase-medieret Germline Transformation i Efteråret Armyworm, Spodoptera frugiperda

Denne protokol viser produktion af transgen Fall Armyworm ved hjælp af piggyBac-baseret transformationssystem. Vi håber, at disse metoder vil gavne forbedringen af transformationen, ikke kun i Fall Armyworm, men også lepidopteran insekter. Den metode, der er beskrevet her, gør kimlintransformationen af lepidopteran skadedyrsinsekter effektiv.

Dr.Xien Chen, en postdoc i mit laboratorium. Begynd med at placere 12 hanunge og 12 kvindelige pupper i en kasse. Placer en 10% saccharoseopløsning i kassen til fodring af voksne.

Dæk kassen med et køkkenrulle. På dag to efter ekslosion, udsætte de voksne til intenst lys natten over. På dag tre efter ekslosionen overføres de voksne til et mørkt sted.

Saml embryonerne inden for to timer efter over position. Tilsæt dråber vand til stykket af køkkenrullen med friske æg opbevaret i en petriskål på is. Overfør æggene forsigtigt til en glasrutschebane med en fin børste og juster dem en efter en på en glasrutschebane.

Hold glasrutschebanerne med æggene justeret på is før mikroinjektion. Indsprøjt en blanding af de 200 nanogram pr. mikroliter piggyBac-baseret EGFP, der udtrykker plasmid, 200 nanogram pr. mikroliter hyperaktiv piggyBac-transposase mRNA, og sterilt destilleret vand i æggene ved hjælp af kompensationstrykket fra den automatiserede mikroinjektor. Hold de injicerede æg på 27 plus eller minus en grad Celsius, 60 plus eller minus 10% relativ luftfugtighed indtil udklækning.

Foder de udklækkede larver på en kunstig kost, og overfør hver larve til en lille kop på den tidlige ostemasse og stjerne scene. Saml pupper og sted ca 150 kvindelige og 150 mandlige pupper i et bur. Hæng flere stykker papirhåndklæder 30 centimeter gange 15 centimeter i størrelse i buret for at samle æggene.

Saml papirhåndklæder med æg dagligt, og hold æggene under passende forhold, indtil udklækning. Hold de nyfødte larver på fire grader Celsius i fem minutter for at immobilisere dem, og overfør dem derefter på en iskold plade. Screen de immobiliserede nyfødte larver under et fluorescens stereomikroskop.

Vælg egfp-positive nyfødte, hæve dem til pupal fase, i omkring to uger på 27 plus eller minus en grad Celsius. Den hyperaktive piggyBac transposase mRNA syntetiseret in vitro blev opdaget ved hjælp af en 1%Agarose gel. De PDS-injicerede embryoner viste ikke EGFP-signal, mens egfp-udtrykke plasmid og hyperaktive piggyBac transposase mRNA-injicerede embryoner viste EGP fluorescens, hvilket indikerer, at piggyBac konstruktionen var vellykket.

G1 larverne fra æg fra et selvkors af G0 voksne viste et stærkt EGFP-signal. Et fragment, der indeholdt promotoren og EGFP-fragmentet, blev forstærket med succes ved hjælp af det genomiske DNA isoleret fra de EGFP-positive larver som skabelon. Det samme fragment blev dog ikke opdaget, da genomisk DNA blev isoleret fra de vilde larver som skabelonen.

Æggene til mikroinjektion skal være så friske som muligt og skal altid opbevares på is før mikroinjektion for at bremse deres udvikling. Denne teknik baner vejen for forskere til at besvare spørgsmål i skadedyr insekt funktionelle genomforskning og udvikle genetiske kontrolmetoder for denne globale skadedyr.