Microelectrode Array Registrering af sinoatrial Node Fyring Sats for at identificere iboende hjerte pacemaking defekter i mus

Måling af iboende puls er en vigtig indikator for hjertesundhed. Denne teknik måler nøjagtigt denne sats, samtidig med at de fleste forvirrende påvirkninger på den sinoatriale knude. MEA-registrering af iboende puls fanger nøjagtige fyringshastighedsdata svarende til enkeltcellede optagelser uden omfattende elektrofysiologitræning.

Personer, der bruger denne teknik, kan have svært ved at opnå sunde vævspræparater i tidlige eksperimenter, så øv dissektionen og optimerer buffere og dataindsamlingsindstillinger, før du begynder den rigtige dataindsamling. Demonstrere proceduren vil være Læger Man Si og Praveen Kumar, post-ph.d.-forskere i mit laboratorium. Begynd med at holde huden på den aflivede mus med en hæmostat og bruge kirurgisk saks til at gøre en tværgående snit i huden lige under bunden af brystkassen fra venstre costal bue til højre costal bue.

Brug kirurgisk saks til at skære op bughinden og omhyggeligt adskille leveren fra mellemgulvet uden nicking leveren for at forhindre overdreven blødning. Incise mellemgulvet langs brystkassen for at afsløre brysthulen. Brug den kirurgiske saks til at skære de laterale vægge af brystkassen fra kanterne af de costal buer op til kraveben til at udsætte hjertet, derefter bruge en 23 gauge sprøjte nål til pin brystkassen over skulderen.

Brug en overførsel pipette til at droppe varm heparinized komplet Tyrode opløsning på hjertet for at holde det fugtigt. Hold lungerne med ekstra fine Graefe-sammentak og skær luftrøret med kirurgisk saks for at fjerne lungerne. For at fjerne hjertet, holde toppen af hjertet med ekstra fine Graefe kraft og skære aorta og ringere vena cava med kirurgisk saks.

Overfør hjertet til en Petriskål indeholdende hærdet silikoneelastomer og brug en overførselspipette til badning af hjertet med to til tre milliliter varm hepariniseret komplet Tyroders opløsning. Fastgør hjertets spids til fadet med en dissektionsstift. Hold den ringere vena cava med Dumont 2 laminectomy forceps.

Indsæt en 22 gauge sprøjte nål gennem ringere og overlegen vena cava at finde deres position i højre atrium, som også identificerer den omtrentlige position af sinoatrial node. Hold det rigtige atrie vedhæng med Dumont 2 laminectomy pinps, og sæt en dissektionsnål gennem det rigtige atrie vedhæng for at holde den på plads. Gentag den samme procedure for venstre atrie vedhæng, og fjern derefter sprøjtenålen, der spænder over vena cavae.

Brug Castroviejo saks til at fjerne toppen af hjertet ved at gøre en tværgående snit på tværs af hjertekamrene for at frigive blodet fra hjertet, derefter vaske hjertet ved at tilføje varm heparinized komplet Tyrode løsning. Brug Castroviejo saks til at skære langs atrioventrikulær septum indtil forkamrene er adskilt fra hjertekamrene og holde snittet tættere på ventrikel. Skær langs den interarterial septum for at fjerne venstre atrium.

Placer dissektionsstifterne i periferien af det højre atrium for at få den til at lægge sig fladt. Fjern eventuelt resterende fedt, fartøjer eller væv fra atriummet ved hjælp af Castroviejo-saksen, og find den sinoatriale knude i højre atrium. Tilføj Tyrodes løsning til inputløsningsmodellen, og tænd for strømmen af carbogengas for at ilte Tyroders løsning.

Indstil den peristaltiske pumpe til 25 omdr./min., hvilket giver en strømningshastighed på to milliliter i minuttet. Når pumpen er startet, skal du sørge for, at bufferen ikke lækker fra systemet, og indstil temperaturregulatoren til 37 grader Celsius. Brug Dumont 55-sammenkædning til at overføre det dissekerede væv fra petriskålen til mikroelektrodematrixen.

Placer forsigtigt vævet med en blød pensel for at overlejre den sinoatriale noderegion i elektrodegitteret. Placer derefter masken over vævet ved hjælp af knogletrakkerne eller eventuelle buede sammenkr vilne. Brug knogletr frem, placer harpeankeret på masken for at holde alt på plads.

Arranger mikroelektrode array skålen på stikpladen. Placer forsigtigt perfusionshætten på mikroelektrodeskålen uden at forstyrre harpeskivens anker og fastgør perfusionskløften med tape. Tænd forstærkeren, og konfigurer en arbejdsgang for optagelsen i softwaren.

Vælg beat_recording. moflo-skabelon. Åbn den og angiv antallet af spor, sporvarighed, sporinterval, indgangsspænding, prøveudtagningshastighed og andre registreringsparametre i henhold til de ønskede registreringsbetingelser.

Klik på optage- og afspilningsknappen for at starte optagelsen og hente data i 10 spor af et minuts varighed med to minutters mellemrum mellem sporene. Sæt pumpen på pause, og skift pumpeindløbsslangen fra den normale optagelsesløsning til Tyroders opløsning, der indeholder det ønskede foretrukne lægemiddel. Genstart pumpen, og fortsæt optagelsen.

Når den lægemiddelinfunderede Tyrodes opløsning har nået vævet, optager 10 spor på samme måde som tidligere for baselineoptagelserne. Tag et sidste billede af placeringen af vævet på mikroelektrode array. Åbn den gemte registrerede datafil i analysesoftwaren med beatfrekvensanalyse.

Klik på afspil og tillade hele optagelsen til at køre for data visualisering og derefter tildele passende analyse parametre. Vælg de kanaler, der skal medtages i analysen, og angiv de ønskede amplitudmaksima- eller amplititude minimatærskelværdier for automatisk bølgeform peakidentifikation. Klik på afspilningsikonet igen for at køre datasættet igen og bekræfte, at analyseparametrene er passende for en spikeudtræk.

Til analyse, identificere de tre mest stabile på hinanden følgende spor, der udviser en stabil slå sats for hvert spor på tværs af de fleste kanaler i den oprindelige periode af eksperimentet og yderligere tre på hinanden følgende stabile spor i løbet af narkotika eksponering periode. Klik på ikonet afspil og optag for at starte analysen. Dataene blev indsamlet fra en 45 dage gammel mandlig vild-type sort schweizisk mus for sinoatrial node beat frekvens måling.

Bølgeformene med forskellige former og amplituder blev observeret i forskellige kanaler, og alle kanaler viste identiske interspike intervaller og fyringsfrekvenser. Imidlertid kan graden af vævskontakt med elektroden også påvirke bølgeformegenskaberne såsom amplitud. Ud af de 10 registrerede spor blev de tre på hinanden følgende kanaler med stabil beatfrekvens og interspikeinterval valgt til yderligere analyse.

De dårlige ekstraherede spike mønstre bør være fraværende, men hvis til stede er enten påvirket af støj eller ustabil. De bølgeformer, der svarer til individuelle hjerteslag afspejler iboende hjerte pacemaking aktivitet. Mikroelektrode array systemet giver mulighed for nem anvendelse af lægemiddelmidler til at analysere de farmakologiske virkninger.

Den iboende affyringshastighed for udvalgte tre spor på tværs af alle 64 kanaler viste sig at være ca. 320 slag i minuttet i prøvetagningsdataene. Indførelsen af 4-aminopyrimidin øgede interspike intervaller som forventet, hvilket reducerede beatfrekvensen fra 320 til 210 slag i minuttet. For at indsamle pålidelige data til analyse er det vigtigt at bekræfte, at væv er sundt under registreringen ved at kontrollere, at sporene er stabile og opfylder standardkriterierne.

MeAs kan bruges til at registrere hjerteaktivitet i andre regioner af hjertet, så detaljeret region-specifikke karakterisering, der er modtagelige for at studere virkningerne af genetisk og farmakologisk manipulation.