Microelectrode Array Recording av sinoatrial node avfyringshastighet for å identifisere iboende hjerte pacemaking defekter hos mus

Måling av egenpuls er en viktig indikator på hjertehelse. Denne teknikken måler nøyaktig denne hastigheten mens den ekskluderer de fleste forvirrende påvirkninger på sinoatrialnoden. MEA-registrering av egenpuls fanger opp nøyaktige avfyringshastighetsdata som ligner på encellede opptak uten omfattende elektrofysiologitrening.

Personer som bruker denne teknikken kan slite med å oppnå sunne vevspreparater i tidlige eksperimenter, så øv på disseksjonen og optimaliser bufferne og datainnsamlingsinnstillingene før du begynner den virkelige datainnsamlingen. Demonstrere prosedyren vil være Leger Man Si og Praveen Kumar, postdoktorer i mitt laboratorium. Begynn med å holde huden på den euthanized musen med en hemostat og bruk kirurgisk saks for å lage et tverrgående snitt i huden like under bunnen av ribbeina fra venstre kostbar bue til høyre kostbar bue.

Bruk kirurgisk saks for å kutte opp bukhinnen og forsiktig skille leveren fra membranen uten å nicking leveren for å forhindre overdreven blødning. Øk membranen langs thoraxen for å eksponere thoraxhulen. Bruk den kirurgiske saksen til å kutte ribbens sidevegger fra kantene på kostbuene opp til kragebenene for å eksponere hjertet, og bruk deretter en 23 gauge sprøytenål til å feste ribbeina over skulderen.

Bruk en overføringspipette for å slippe varm heparinisert komplett Tyrodes løsning på hjertet for å holde den fuktig. Hold lungene med ekstra fine Graefe tang og kutt luftrøret med kirurgisk saks for å fjerne lungene. For å fjerne hjertet, hold toppen av hjertet med ekstra fine Graefe tang og kutt aorta og dårligere vena cava med kirurgisk saks.

Overfør hjertet til en Petri-tallerken som inneholder herdet silikonelastomer og bruk en overføringspipette for å bade hjertet med to til tre milliliter varm heparinisert komplett Tyrodes løsning. Fest toppen av hjertet til parabolen med en disseksjonspinne. Hold den dårligere vena cava med Dumont 2 laminectomy tang.

Sett inn en 22 gauge sprøytenål gjennom den dårligere og overlegne vena cava for å finne sin posisjon i riktig atrium, som også identifiserer den omtrentlige posisjonen til den sinoatriale noden. Hold høyre atrievedheng med Dumont 2 laminektomi tang, og legg en formidlingspinne gjennom høyre atrievedheng for å holde den på plass. Gjenta den samme prosedyren for venstre atrievedheng, og fjern deretter sprøytenålen som spenner over vena cavae.

Bruk Castroviejo saks for å fjerne toppen av hjertet ved å lage et tverrgående snitt over ventriklene for å frigjøre blodet fra hjertet, og vask deretter hjertet ved å legge til varm heparinisert komplett Tyrodes løsning. Bruk Castroviejo saks til å kutte langs atrioventrikulær septum til atriene er skilt fra ventriklene og hold snittet nærmere ventrikelen. Klipp langs interarterial septum for å fjerne venstre atrium.

Plasser disseksjonspinnene i periferien av høyre atrium for å få det til å ligge flatt. Fjern eventuelt gjenværende fett, kar eller vev fra atriet ved hjelp av Castroviejo-saksen og finn den sinoatriale noden i høyre atrium. Tilsett Tyrodes løsning i inngangsløsningsmodellen og slå på strømmen av karbogengass for å oksygenere Tyrodes løsning.

Sett den peristaltiske pumpen til 25 RPM, noe som gir en strømningshastighet på to milliliter per minutt. Etter at du har startet pumpen, må du sørge for at bufferen ikke lekker fra systemet og sett temperaturregulatoren til 37 grader Celsius. Bruk Dumont 55 tang til å overføre det dissekerte vevet fra dissekering Petri parabolen på mikroelektrode array rutenettet.

Plasser vevet forsiktig med en myk pensel for å legge over sinoatrial nodeområdet i elektrodegitteret. Plasser deretter nettet over vevet ved hjelp av bein tang eller buede tang. Bruk bein tang, plasser harpeankeret på nettet for å holde alt på plass.

Ordne mikroelektrode array-parabolen på kontaktplaten. Plasser forsiktig perfusjonshetten på mikroelektrode array-parabolen uten å forstyrre harpeskiveankeret og fest perfusjonsgapet med tape. Slå på forsterkeren og sett opp en arbeidsflyt for innspillingen i programvaren.

Velg beat_recording. moflo-mal. Åpne den og angi antall spor, sporvarighet, sporintervall, inngangsspenning, samplingsfrekvens og andre registreringsparametere i henhold til de ønskede opptaksbetingelsene.

Klikk på opptaks- og avspillingsknappen for å starte innspillingen og hente data for 10 spor av ett minutts varighet med to minutter med intervaller mellom sporene. Sett pumpen på pause og sett pumpeinnstrømningsslangen på pause fra den vanlige opptaksløsningen til Tyrodes løsning som inneholder ønsket valgte legemiddel. Start pumpen på nytt og gjenoppta opptaket.

Når den legemiddelinfunderte Tyrodes løsning har nådd vevet, registrerer du 10 spor på samme måte som tidligere for basisopptakene. Ta et siste bilde av plasseringen av vevet på mikroelektrode arrayet. Åpne den lagrede registrerte datafilen i beatfrekvensanalysemalen til analyseprogramvaren.

Klikk på stykket og la hele innspillingen kjøre for datavisualisering og tilordne deretter passende analyseparametere. Velg kanalene som skal inkluderes i analysen, og angi de ønskede amplitude maxima- eller amplitude minima-terskelverdiene for automatisert toppidentifikasjon for bølgeform. Klikk på avspillingsikonet igjen for å kjøre datasettet på nytt og bekrefte at analyseparametrene passer for en spikeuttrekking.

For analyse, identifiser de tre mest stabile påfølgende sporene som viser en stabil slagrate for hvert spor på tvers av de fleste kanaler i løpet av eksperimentets basisperiode og ytterligere tre påfølgende stabile spor i løpet av narkotikaeksponeringsperioden. Klikk spill av og spill inn-ikonet for å starte analysen. Dataene ble samlet inn fra en 45-dagers mannlig villtype svart sveitsisk mus for sinoatrial node beatfrekvensmåling.

Bølgeformene med forskjellige former og amplituder ble observert i forskjellige kanaler, og alle kanalene viste identiske interspikeintervaller og avfyringsfrekvenser. Imidlertid kan graden av vevskontakt med elektroden også påvirke bølgeformegenskapene som amplitude. Fra de 10 registrerte sporene ble de tre påfølgende kanalene med stabil beatfrekvens og interspikeintervall valgt for videre analyse.

De dårlige ekstraherte piggmønstrene skal være fraværende, men hvis de er til stede, påvirkes de enten av støy eller ustabile. Bølgeformene som tilsvarer individuelle hjerteslag reflekterer egen hjerte-pacemaking aktivitet. Mikroelektrode array-systemet gjør det enkelt å bruke legemiddelmidler for å analysere de farmakologiske effektene.

Den iboende avfyringshastigheten til utvalgte tre spor på tvers av alle de 64 kanalene ble funnet å være omtrent 320 slag per minutt i prøvetakingsdataene. Innføringen av 4-aminopyrimidin økte interspike intervallene som forventet, noe som reduserte beatfrekvensen fra 320 til 210 slag per minutt. For å samle pålitelige data for analyse, er det viktig å bekrefte at vev er sunt under registrering ved å bekrefte at sporene er stabile og oppfyller standardkriteriene.

MEAer kan brukes til å registrere hjerteaktivitet i andre områder av hjertet, slik at detaljert regionspesifikk karakterisering som er egnet til å studere effekten av genetisk og farmakologisk manipulasjon.