Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Shuttle Box Assay spårar reproducerbart progressionen och återhämtningen av kognitiv svikt efter ett trubbigt våld trauma eller någon annan typ av hjärnskada hos zebrafisk. Shuttle Box Assay möjliggör relativt enkel, snabb och robust mätning av associativt lärande i både kort- och långtidsminne i zebrafisk. Till att börja med, förbered Shuttle Box genom att modifiera en 30,5 med 19 med 7,5 centimeter gellåda med en 5 till 19 centimeter bit av akvariekvalitet plexiglas som läggs till varje sida i 45 graders vinkel.

Gör sedan en linje som markerar tankens halvvägspunkt för att bedöma när fisken har korsat mitten av tanken. Efter att ha tillslat 800 milliliter systemvatten till Shuttle Box, placera två till tre fiskar i en hålltank som innehåller systemvatten. Lämna tanken i det mörka rummet där Shuttle Box Assay kommer att utföras.

Placera sedan en fisk i mitten av Shuttle Box i det mörka rummet. Fäst locket och fäst elektroderna på en strömförsörjning. Fisken ska acklimatiseras i mörkret.

Släck alla lampor och acklimatisera fisken till Shuttle Box i 15 minuter. Framgångsrik acklimatisering kan övervägas när fisken fritt utforskar tanken. Efter framgångsrik acklimatisering av fisken, lyser manuellt en 800 lumen röd lins ficklampa ungefär två centimeter från gelboxväggen på sidan som upptas av fisken.

Starta inte en provperiod om fisken vilar bredvid platinatråden. Lys ljusstimulansen direkt på fisken och följ manuellt fiskens laterala rörelse med ljuset för att säkerställa kontinuerlig visualisering av stimulansen. Fortsätt att ge ljusstimulansen tills något av följande villkor för en lyckad eller misslyckad prövning är uppfyllda.

Betrakta försöket som framgångsrikt om fisken korsar tankens halvvägspunkt inom 15 sekunder efter ljusexponering. När fisken korsar halvvägs, stoppa ljusstimulansen omedelbart. Om försöket misslyckades, använd en elektrofores strömförsörjning för att applicera en negativ chockstimulans på 20 millivolt på en ampere, alternerande två sekunder på, två sekunder av i 15 sekunder med högst fyra stötar eller tills fisken passerar halvvägs av lådan.

Avsluta sedan både den lätta och negativa stimulansen. Före träningsperioden, se till att transferboxen acklimatiseras genom att lämna fisken under mörka förhållanden i 15 minuter. Lys sedan manuellt en 800 lumen röd lins ficklampa ungefär två centimeter från gelboxväggen på sidan som upptas av fisken.

Lys ljusstimulansen direkt på fisken och följ fiskens laterala rörelse med ljuset för att säkerställa kontinuerlig visualisering av stimulansen. Medan ljuset lyser på fisken, applicera samtidigt den negativa chockstimulansen på 20 millivolt på en ampere, alternerande två sekunder på, två sekunder av i 15 sekunder med högst fyra stötar eller tills fisken passerar lådans halvvägspunkt. När detta har uppnåtts, avsluta ljuset och den negativa stimulansen.

Upprepa i 25 iterationer. Efter avslutad, låt fisken en annan acklimatiseringsperiod på 15 minuter under mörka förhållanden. Under den första testperioden, utför en lyckad acklimatisering i Shuttle Box i 15 minuter och applicera sedan endast ljusstimulansen i upp till 15 sekunder och spela in svaren.

Tänk på att försöket lyckas om fisken korsar halvvägs i Shuttle Box inom 15 sekunder efter att ha startat ljusstimulansen och stoppa ljusstimulansen omedelbart när fisken korsar halvvägspunkten. Betrakta försöket som misslyckat om fisken inte korsar halvvägs i Shuttle Box 15 sekunder efter att ha startat ljusstimulansen och stoppa ljusstimulansen efter 15 sekunder. Under den första testningen ska du inte tillämpa en negativ stimulans efter ett misslyckat försök.

Utför korttidsminnestestning omedelbart efter den första testperioden. Inducera dramatisk hjärnskada och vänta i fyra timmar innan du testar. Acklimatisera sedan fisken i Shuttle Box i 15 minuter.

Utvärdera korttidsminnet genom att endast applicera ljusstimulansen i upp till 15 sekunder och registrera om fisken korsar över lådans halvvägspunkt innan ljuset stängs av, betraktas som godkänd prövning eller misslyckas med att korsa halvvägspunkten inom de 15 sekunder som anses vara misslyckad prövning. Upprepa ovanstående steg 25 gånger med en viloperiod på 30 sekunder mellan varje försök och registrera antalet lyckade och misslyckade försök. Utför långtidsminnestestning fyra dagar efter inledande testning.

Inducera traumatisk hjärnskada och vänta i fyra timmar innan du testar, acklimatisera sedan fisken i Shuttle Box i 15 minuter. Utvärdera långtidsminnet genom att endast applicera ljusstimulansen i upp till 15 sekunder och registrera om fisken korsar över lådans halvvägspunkt innan ljuset stängs av, betraktas som godkänd prövning eller misslyckas med att korsa halvvägspunkten inom de 15 sekunder som anses vara misslyckad prövning. Upprepa ovanstående 25 gånger med en viloperiod på 30 sekunder mellan varje försök och registrera antalet lyckade och misslyckade försök.

Den instruktionsöversikten över inlärnings- och minnesparadigm för kognitiv bedömning visas här. Den oskadade fisken vid åtta månader, ung vuxen, 18 månader, medelålders vuxen och 24 månader, äldre vuxen, krävde ett liknande antal prövningar för att lära sig beteendet att undvika rött ljus. Efter att ha använt den allvarliga trubbiga kraften traumatisk hjärnskada modell, eller STBI, fisken i olika åldrar krävde ett liknande antal prövningar för att behärska analysen över en till fem dagar efter skada.

På dag ett efter STBI krävde fisk i alla åldrar ett liknande antal försök för att lära sig beteendet, vilket var betydligt större än de oskadade kontrollerna. Den oskadade fisken behärskade snabbt Shuttle Box och uppnådde fem på varandra följande positiva försök i cirka 17 försök medan en dag efter en mild hjärnskada, eller en mild TBI, visar fisk en betydande ökning av antalet försök för att lära sig beteendet. Detta underskott ökade efter två milda TBI och höjdes ytterligare efter tre milda TBI skador.

Oskadad fisk uppvisar en liten ökning av procentskillnaden av framgångsrika försök i omedelbart minne och fördröjd minne i förhållande till den första testperioden. Efter en enda mild TBI uppvisade fisken betydande och omedelbara minnesunderskott jämfört med oskadad fisk. Denna trend fortsatte med upprepade skador med ökande underskott efter både två milda TBI och tre milda TBI.

Tidpunkten för tillämpade negativa stimuli är kritisk. Att para ihop de negativa stimuli med ljuset och deras samtidiga avlägsnande stärker deras association och är avgörande för paradigmet. Analysen möjliggör snabb bedömning eller komplext associativt lärande som kan användas för att undersöka utvecklings-, åldrande- och miljöpåverkan på kognitiv svikt.