Одновременная томографическая визуализация Брайтфилда, флуоресценции и оптической когерентности сократителения сердечных трабекул Ex Vivo

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать интеграцию трех систем визуализации в одно устройство, что позволяет одновременно измерять механическую функцию, ионную динамику и геометрическое изменение сокращаящейся ткани сердца. В частности, мы измеряем выработку силы ткани, переходные процессы кальция, локальные смещения и изменение формы. Сочетание этих методов визуализации может помочь ответить на ключевые вопросы при сердечных заболеваниях, что будет быть важно для разработки эффективных стратегий лечения.

Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет изучать неоднородность мышечной активности. Устройство, используемое в этом протоколе, содержит три системы визуализации, способные визуализмть один и тот же образец, микроскоп яркого поля, флуоресцентный микроскоп и оптический когерентный томограф. Серия дихроичных зеркал используется для разделения флуоресцентного излучения и изображения передачи яркого поля.

Принципиальными особенностями данного устройства являются два независимо приводимых в действие монтажных крючка, измерительная камера с тремя оптически четкими осями и внешняя триггерная линия, синхронизировающая яркое поле и OCT-камеры со стимулятором. В этом видео мы покажем, как изолировать, подготовить и изобразить сердечные трабекулы и представить некоторые репрезентативные результаты. После иссечения сердца у обезболенной крысы перенесите его в рассеченную камеру.

Используя два изогнутых щипца, потяните аорту над перфузионной канюлью. Удерживайте аорту на месте одним деспом. Между тем, откройте линию трубки, чтобы раствор для рассечения протекал через перфузионную канюлю.

После того, как коронарная сосудистая клетка очищена от крови и сердце полностью перфузировано раствором для рассечения, закрепите аорту на месте с помощью шва. Расположите сердце, поверните канюлю так, чтобы левая коронарная артерия была видна на верхней поверхности. Прикрепить вершину сердца к нижней части камеры рассечения.

Отрежьте оба предсердия. Разрезать вдоль правой стороны перегородки до верхушки сердца. Прикрепить открытый левый желудочек к основанию рассеченной камеры.

Затем, разрезая вдоль левой стороны перегородки, откройте правый желудочек и прикрепите его к основанию рассеченной камеры. Определите свободно работающий трабекул в правом желудочке. С помощью пружинных ножниц и щипца срежьте ткань стенки, окружающую трабекулу.

Затем разрезают ткань стенки пополам, ортогонально в направлении трабекулы. Обрежьте ткань стены до тех пор, пока ее размер не будет соответствовать используемой конфигурации монтажа. Оставьте иссеченную трабекулу в рассеченной камере.

Промывайте горячую воду, дистиллированную воду, а затем суперфузор раствором через измерительную камеру. Включите источник света яркого микроскопа и нажмите клавишу F1, чтобы включить захват. Вручную отрегулируйте нисходящий крюк, пока он не будет центрирован на изображении яркого поля.

Щелкните нулевую нисходящую ось, затем отключите нисходящий поток, чтобы включить двигатель. Перемещайте ползунок заданного значения вниз по потоку до тех пор, пока конец крючка не выровняется с краем интересуемой области по умолчанию. Повторно обнулите нисходящую ось, затем переместите ползунок заданного значения нисходящего потока на 1 000.

Повторите процесс с восходящим хуком, но не перемещайте ползунок заданного значения восходящего потока после повторного обнуления оси восходящего потока. Нажмите кнопку Переместить к монтирование. Запустите систему флуоресцентного освещения, переключив переключатель лампы перед быстрым включением подсистем контроллера, переключив главный переключатель.

Переключите режим работы на турбо гашение, нажав кнопку режима на передней панели, затем две, затем одну. Нажмите кнопку online, чтобы включить внешнее управление. Приостановите поток суперсмешка через измерительную камеру.

Заполните монтажную камеру раствором для рассечения. Используя одномиллилитровой шприц, транспортировать трабекулу из камеры рассечения в монтажную камеру. Позвольте трабекуле опуститься в монтажную камеру под действием силы тяжести.

Опустить уровень жидкости в монтажной камере так, чтобы он был на одном уровне со средней частью крючков. Отрегулируйте расстояние между крючками, чтобы отразить длину слабины трабекулы, переместив ползунок заданного значения вниз по потоку. Используя микроскоп для облегчения визуализации, слегка захватите один из кусков торцевой ткани щипцами и установите его на крючок вверх по течению.

Установите другой кусок торцовой ткани на крючок ниже по течению. После надежного крепления переместите трабекулу обратно в измерительную камеру, нажав кнопку, переместите в камеру и возобновите поток суперсмешения. Установите частоту стимула на один, продолжительность стимула на 10 и напряжение стимула на 10.

Начните стимуляцию, нажав на стимул. Включите систему освещения brightfield. Нажмите клавишу F1 и выберите интересуяшую область, которая заключает в себя полосатую область пользовательского интерфейса.

Щелкните Вычислить длину саркомера, чтобы вычислить среднюю длину саркомера в выделенной области. Увеличивайте длину мышц до тех пор, пока средняя длина саркомера не увеличится примерно на 2,32 мкм. Переместите мышцу, отрегулировав ползунок центрального заданного значения на вкладке управления центром и разделением так, чтобы край нисходящего крючка был виден только на изображении яркого поля.

Соберите информацию о флуоресценции для 10 подергиваний. Увеличьте значение центрального заданного значения на 200 и соберите еще 10 подергиваний флуоресцентной информации. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока изображение яркого поля не будет содержать восходящий крюк.

Соберите информацию о флуоресценции последнего окна. Верните трабекулу в центральное положение, установив нулевое значение центрального заданного значения. Уменьшите частоту стимула до 0,2 Герц и переключитесь с суперфузата K-H на загрузочный раствор Fura-2.

Измеряйте флуоресцентный сигнал каждые 10 минут. Визуализируйте сигнал на вкладке сигнал PMT. После того, как 360-нанометровый сигнал увеличился в 10 раз, верните частоту стимула к одному герцу и переключитесь обратно на раствор суперфузата K-H.

Проверяйте измерение соотношения каждые 10 минут, пока сигнал не стабилизируется, после чего может начаться сбор данных. Верните мышцу в положение, где край нисходящего крючка только что присутствует в ярком изображении. Захватите информацию о флуоресценции, щелкнув Включить источник флуоресценции.

Начните потоковую передачу данных оборудования. В пользовательском интерфейсе brightfield Imaging установите режим захвата на внешний триггер, увеличьте частоту кадров до 100 Гц и установите количество изображений для захвата на 100. Нажмите control-shift-S, а затем F1, чтобы записать данные изображения яркого поля для этого окна.

Увеличьте центральное заданное значение на 200 и повторите процесс захвата яркого поля. Продолжайте работу с протоколом сканирования до тех пор, пока данные изображения не будут собраны для последнего окна. Верните трабекулу в центральное положение, установив нулевое значение центрального заданного значения.

Включите источник подсветки oct, повернув главную клавишу, нажав кнопку питания, а затем кнопку SDS. Накройте головку гальванометра и нажмите получить фон, чтобы измерить фоновую интерференционную картину и вычесть ее из измерения. Установите режим захвата изображения в режим live view.

Центрируйте трабекулу по осям X и Y, регулируя значения смещения X и Y. Центрируя трабекулу, сканируйте вдоль оси Y, регулируя положение Y, чтобы найти положения, соответствующие крючкам вверх и вниз по течению. Запишите эти позиции вниз.

Установите диапазон Y в абсолютную разницу между этими значениями, деленную на 10. Установите в режиме захвата изображения значение стимула, диапазон X до 100 и нажмите кнопку установки активных параметров. Щелкните потоковые данные, а затем приобретите.

Для того, чтобы захватить региональную информацию о кальции и ярком поле для всей длины трабекулы, представленной здесь, потребовалось семь мышечных положений. Эта цифра средней силы от каждого из наложенных положений позволяет предположить, что сила подергивания не была тронута этим движением, показывая, что не было позиционной зависимости от акта производства силы. Эти сканирования, собранные с помощью оптической когерентной томографии со скоростью 100 Гц, были сегментированы с помощью плагина ImageJ Weka.

Каждое поперечное сечение выглядит искаженным из-за разницы между боковым и глубинным разрешениями. Это было исправлено путем масштабирования каждой оси независимо от ее соответствующего разрешения. После масштабирования сырого С-сканирования трабекулы мышца примерно цилиндрическая.

Отражение стенки измерительной камеры иногда может перекрываться с мышечными данными, но программное обеспечение сегментации может быть обучено учитывать это. После сегментировки площадь поперечного сечения по длине мышцы может быть рассчитана на протяжении всего подергивания. Обратите внимание, что именно эта трабекула имеет небольшую ветвь.

Движение ветви очевидно примерно на полпути вдоль трабекулы. Наконец, сегментированные изображения могут быть преобразованы в сетки, чтобы помочь в построении геометрических моделей. Данные визуализации, полученные в каждой из семи позиций со скоростью 100 кадров в секунду, были сшиты вместе, чтобы создать единое полное изображение трабекулы.

Отношение опущенной флуоресценции, связанной с 340 и 380 нанометровым светом возбуждения, коррелирует с внутриклеточным кальцием после того, как трабекула была загружена Fura-2. В среднем 10 внутриклеточных переходных процессов кальция из каждого окна выровнены с областью, в которую они были изображены. В то время как пик переходных процессов для этой трабекулы кажется достаточно последовательным, диастолический кальций уменьшается по всей его длине.

Аналогичным образом, результаты отслеживания смещения и расчетов длины саркомера также указывают на наличие региональной изменчивости. Используемая техника отслеживания без маркеров способна рассчитать смещение каждого пикселя. Пригодность оценок длины саркомера была проверена на основе ширины и амплитуды гауссовского соответствия сигналу БПФ.

Эти условия не были выполнены в мышечной области между нулем и 500 микронами, поэтому там не было вычислено никакой информации о длине саркомера. Учитывая связанные с этим смещения, вполне вероятно, что саркомы в этой области удлинялись во время сократительной фазы подергивания. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изолировать сердечные трабекулы и надежно подготовить их к мультимодальной визуализации.

Этот процесс устанавливает путь для сбора набора данных, необходимых для построения физиологически обоснованных конечно-элементных моделей сокращения сердечной ткани.