Biology
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ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法
Chapters
Summary August 27th, 2021
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本プロトコルは、人工培地を用いて穿刺吸引昆虫から十分な唾液を採取する方法を説明する。昆虫の唾液を採取し、昆虫の摂食行動やベクター媒介ウイルス感染に関する唾液機能を研究する便利な方法です。
Transcript
人工給餌および唾液採取は、昆虫唾液中のエフェクターを検出するための直接的な方法を提供する。しかし、これは以前に詳細には説明されていません。このプロトコルは、サプロフィズ昆虫からの唾液採取に有効である。
さらに、 スクロースのみを含む培地を人工的な食事として使用するので、それは簡単なテクニックです。サプロフィズ型の昆虫の唾液は、餌の行動に利益をもたらし、病原体を伝播するために宿主の免疫系に影響を与える可能性があります。昆虫の行動や虫骨の経路研究に使用できるこの薬。
これは、実行する簡単な方法です。しかし、これは、唾液としてのクリーンな実験環境の実装がさらなる研究のために収集されていることを示唆している。人工食餌に5%スクロース溶液を調製し、0.22ミクロンのフィルターを介して溶液を濾過し、細菌の汚染および不純物を除去します。
約200匹の小さな茶色の植物ホッパーの幼虫を3〜5時間飢えさせ、給餌室に導入します。次に、ガラスシリンダーを給餌室として準備し、実験用昆虫を導入する前に、チャンバーの一方の開いた端をパラフィン膜で覆い、次に昆虫をガラスシリンダーに移し、延伸したパラフィン膜でチャンバーの反対側を覆う。膜に200マイクロリットルの人工食を加え、その後、伸ばしたパラフィン膜の別の層で液体を覆います。
最後に、アルミニウム箔でチャンバーを覆い、光にさらされた人工ダイエット装置で端を残します。24時間後、昆虫を固定するために4度でシリンダーを冷却してSBPH唾液を採取し、外膜を発見し、無菌ピペットを使用して人工食餌を1.5ミリリットルの無菌管に集めます。分析まで、収集した唾液をマイナス80度に保ちます。
次に、50マイクロリットルの新鮮な人工食で内膜を柔らかくピペットして3回洗い流し、人工洗浄食を1.5ミリリットルの無菌チューブに集めます。3リンスの後、内膜に新鮮な人工食を加え、上に伸ばした新しいパラフィン膜を置きます。最後に、収集したサンプルを0.22ミクロンのフィルターユニットでフィルターし、微生物やその他の汚染物質を除去します。
500マイクロリットル、10キロダルトン遠心フィルターで集団唾液サンプルを移動します。サンプルを遠心分離します。上清を収集し、100マイクロリットルに最終容積を持ち出します。
採取した唾液の濃度を測定するには、UV可視分光光度計をオンにし、二重蒸留水でペダーを3回洗います。次の順序で画面上のオプションを選択します, タンパク質, プロテイン A280.1ミリリットル当たり1ミリグラムに等しいタイプと1吸光度単位を選択します。
次に、ベースライン補正のチェックボックス(340ナノメートル)をチェックします。次に、5%スクロース水溶液の2マイクロリットルをブランクとしてロードし、画面の下部にあるブランクをタッチします。最後に、基準を設定した後、集めた唾液の2マイクロリットルをロードし、タンパク質濃度を記録する。
5%スクロースを食べたとき、SBPHの80%以上が最初の4日間生存した。しかし、5日目以降、死亡率は40%に急速に増加し、7日目にはSBPHの半分以下が生存した。SDSページ分析では、RSV感染したSBPH唾液からの濃縮唾液サンプルには、5%スクロース陰性対照よりも多くのタンパク質が含まれていることが示された。
RSVカプシドタンパク質の検出のためのウェスタンブロット分析では、非感染およびウイルス性の昆虫である。RSVキャプシドタンパク質は、LssgMP遺伝子産物に対して設計された抗体であるviruliferousサンプルで正常に検出され、非感染およびウイルス増殖性サンプル中の78キロダルトンタンパク質を検出し、LssgMPが唾液タンパク質であることを実証した。異なる組織におけるLssgMP転写レベルのQRT PCR分析は、唾液腺のLssg転写レベルが全身および腸内よりも20倍高いことを示し、唾液腺におけるLssgMPの特異的発現を確認した。
実験用昆虫をチャンバーに導入する前に飢えることは、唾液の収集の効率を確保するために必要です。また、人工培地を収集し、収集したサンプル中の微生物汚染を減らすために24時間ごとに交換する必要があります。この技術は、感染病原体における唾液の機能を研究する直接的な方法を提供する。
さらに、昆虫病原体の宿主の相互作用を研究するのに役立ちます。
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