Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Denne protokollen bruker superoppløselig mikroskopi, spesielt direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi, også kjent som dSTORM, for å omgå diffraksjonsgrensen og for å visualisere elbiler med nanometerpresisjon i tre dimensjoner. En bemerkelsesverdig fordel med dSTORM er dens evne til å visualisere partikler direkte under diffraksjonsnivået av lys uten skadelige trinn som endrer EV-ens biokjemiske natur. Mange evolusjonært distinkte virus bruker EV-signalering, derfor kan dSTORM brukes til å karakterisere elbiler for sykdomsbiomarkører og progresjon, samt å visualisere individuelle viruspartikler, for eksempel SARS-CoV2. Begynn med å plassere affinitetsrensede, ekstracellulære vesicles, eller ELBILER, på glassbunn, mikroslide, åtte brønnplater i et totalt volum på 200 mikroliter, og la dem holde seg til overflaten over natten ved fire grader Celsius.

Uten å fjerne den eksisterende løsningen fra åttebrønnsplaten, fest elbiler på platene ved å tilsette 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 1X PBS til DEN EV-inneholdende løsningen i hver brønn og la platene inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig paraformaldehyd og overflødig løsning med en mikropipette for ikke å forstyrre ELBIL-ene. Vask EV med 1X PBS for å fjerne overflødig paraformaldehyd.

Utfør vaskeprosedyren tre ganger. Fjern overflødig 1X PBS. Forbered 250 mikroliter dSTORM Bcubed bufferløsning per prøve ved å lage en løsning på fem millimolar protocatechuic dioxygenase fortynnet i bildebuffer i henhold til produsentens protokoll.

Tilsett 250 mikroliter av den forberedte bufferen til hver brønn i henhold til produsentens protokoll, og inkuber platene i 20 minutter ved romtemperatur før avbildning for å samle oksidasjonsmolekyler. ELBIL-ene kan visualiseres umiddelbart eller lagres ved fire grader Celsius i en uke. For å forberede perlene som kreves for kalibrering av superoppløsningsmikroskopet, fortynn 100 nanometermikrosfærer til en konsentrasjon på 0,5% i molekylærbiologisk vann, og pipette 200 mikroliter i hver brønn av en glassbunn, mikroslide, åttebrønns plate.

La perlene bosette seg i brønnene i en time ved romtemperatur. Uten å fjerne den eksisterende løsningen, tilsett 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønn til kalibreringsperleløsningen, og la den inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig paraformaldehyden med en mikropipette for ikke å forstyrre perlene, og vask perlene tre ganger med 1X PBS.

Klargjør bufferen som beskrevet i manuskriptet. Fjern 1X PBS og tilsett 250 mikroliter av den klargjorte bufferen til hver brønn. La bufferen sitte i 20 minutter før visualisering.

Bruk knappen Koble til mikroskopet for å koble til 3D-mikroskopet før du plasserer noe på scenen. Tilsett 100X olje til målet, og plasser midten av brønnen på toppen av målet. I Acquire-innstillingen slår du på 473- og 640-nanometer eksitasjonslasere og klikker på Vis.

Uten å aktivere 3D-objektivet, kan du se perlene under foto metningsinnstillingen ved å klikke på Foton-tellinger i bildevisningsalternativene. Sett de første laserkraftene til 8,4 milliwatt for 473-nanometerlaseren og 11,6 milliwatt for 640-nanometerlaseren. Reduser fokuset på laseren til rundt minus 300 nanometer eller fokusplanet til kalibreringsperlene for å produsere en klar oppløsning av de enkelte perlene.

Når Z-flyet er fokusert, justerer du lasereffektnivåene ytterligere for å ta høyde for variasjon i hvert synsfelt. Under Instrument-funksjonene fullfører du kalibrering av 3D-kartlegging og kanalkartlegging for å få feilene på X-, Y- og Z-aksen. Sett maksimalt antall synsfelt til 20, målnummeret for punkt til 4 000, maksimal avstand mellom kanaler til 5,0 piksler og ekskluderingsradiusen mellom kanaler til 10,0 piksler under kanaltilordningskalibrering.

Sørg for at kalibreringen gir en punktdekning på mer enn 90 %, og at kartkvaliteten er god. Lagre de gitte kalibreringsdataene for fremtidige bildeanskaffelser. Tilsett 100X olje på målet, og plasser de forberedte ELBIL-ene på mikroskopet.

Uten å aktivere 3D-objektivet, slå på 640-nanometerets eksitasjonslaser, og øk det først til mellom 1,2 og 12,5 milliwatt, avhengig av intensiteten av signalet i synsfelt for å begeistre den røde membranen, interkalerende, fargefargede elbiler. Under Visningsalternativer for bilde bytter du visningsmetoden fra fotometning til persentiler for å visualisere EVene bedre. Juster lasereffekten for å minimere støy samtidig som du maksimerer signalet og opprettholder alle andre parametere.

Juster fokuset på Z-planet ved å klikke opp- eller nedikonet på Z-aksen. Sett eksponeringstiden til 20 millisekunder, rammeopptaket til 10 000 bilder og den første lasereffekten til mellom 1,2 og 12,5 milliwatt, avhengig av intensiteten til signalet og synsfeltet. Aktiver 3D-objektivet ved hjelp av ikonet, og start oppkjøpet ved å klikke på Hent-knappen.

Gjennom hele bildeanskaffelsesprosessen øker du laserkraften med tre trinn på 10 hver 1000 bilder, eller nok til å opprettholde et høyt signal-til-støy-forhold. Z-flyet må ikke justeres under oppkjøpet. Når du har anskaffet bildet, bytter du til visningsvinduet Analyser.

Utfør driftkorrigering på det ufiltrerte bildet, og aktiver deretter filtre. Juster antall fotoner, lokaliseringspresisjon, sigmaer og rammeindeks, som nevnt i manuskriptet. Legg over et X-, Y-, Z-plane-visningsverktøy langs X-aksen til individuelle ELBILER fra synsfeltet, og eksporter de enkelte CSV-filene med fotoswitching-hendelser.

Bisect individuelle elbiler på X, Y-aksen i et X by Y-synsfelt ved hjelp av et Line Histogram-verktøy, som fester photoswitching-hendelser i angitte avstandsgrupper. Ta bilder av enkelt-ELBILER og lagre dem som tif-filer. Lag 3D-videoer av individuelle elbiler ved hjelp av et 3D-visualiseringsverktøy og farge i henhold til plassering langs Z-aksen.

Etter kalibreringen av mikroskopet som produserte en gjennomsnittlig feil på 16 nanometer på X- og Y-aksen og 38 nanometer på Z-aksen, ble de rensede u20s-EVene vellykket visualisert med en oppløsning på opptil 20 nanometer på X-, Y-aksen og 50 nanometer langs Z-aksen. Individuelle elbiler visualisert gjennom dSTORM i 3D-bilder som ble forhekset gjennom hele 10.000-rammeeksponeringen etter hvert som lasereffekten ble økt, og var lett synlig i det oppkjøpte bildet. Bildekorrigering etter anskaffelse i Z-planet, fotontellinger, sigmaer og lokaliseringspresisjon for det rekonstruerte bildet resulterte i en klar oppløsning av EV i 3D.

EV-bildene ble bare tatt i løpet av de første 7000 rammene, sett av legenden i øvre høyre hjørne. Histogrammet bekrefter at de fleste photoswitching-hendelser skjedde innenfor en radius på 100 nanometer, og bekreftet at den visualiserte EV er et eksosom, og at isolasjonen av elbiler med liten diameter var vellykket. Størrelsesfordelingsanalyse utført på andre individuelt sporede elbiler ved hjelp av Line Histogram-verktøyet og X, Y, Z-plane View-verktøyet bekreftet at de fleste photoswitching-hendelser skjedde innenfor en radius på 100 nanometer i midten.

Feilen langs Z-aksen ble økt, noe som ga et langstrakt sluttbilde av EV langs aksialaksen. Photoswitching-hendelser var ikke korrelert med EV-størrelse, noe som viser at dSTORM-basert karakterisering kan brukes til små elbiler som eksosomer og små, innhyllede virus mindre enn 100 nanometer i diameter. Mens du utfører dSTORM, er det viktig å huske å sette den første laserstrømmen veldig lav, og sakte øke den gjennom bildeanskaffelse for å forhindre fotobleaching.

Siden utviklingen har dSTORM gjort det mulig for forskere å bedre forstå morfologien til sub-cellulære strukturer som tidligere har vært umulig å visualisere på grunn av diffraksjonsgrensen for typisk lysmikroskopi.