Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Global identifikasjon av samoversettelsesinteraksjonsnettverk ved selektiv ribosomeprofilering
Chapters
Summary October 7th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Samoversettelsesinteraksjoner spiller en avgjørende rolle i nascent-kjedemodifikasjoner, målretting, folding og monteringsveier. Her beskriver vi Selektiv Ribosome Profilering, en metode for in vivo, direkte analyse av disse interaksjonene i modellen eukaryote Saccharomyces cerevisiae.
Transcript
Samoversettelsesinteraksjoner spiller en avgjørende rolle i gryende kjedemodifikasjoner rettet mot folde- og monteringsveier. Her beskriver vi selektiv ribosomprofilering, en metode for in vivo direkte analyse av disse interaksjonene i modellen eukaryote Saccaromyces cerevisiae. Selektiv ribosomprofilering er den eneste metoden til dags dato som fanger opp og karakteriserer kooversettelsesinteraksjoner in vivo på en direkte måte.
Selektiv ribosomeprofilering muliggjør global profilering av alle faktorer og interaksjoner med oversettelse av ribosomer i nesten-codon-oppløsning. Begynn med å samle de konstruerte gjærcellene som inneholder de ønskede taggede proteinene. Utfør cellelys med kryogen sliping i en miksermølle to ganger i to minutter ved 30 Hertz.
Sentrifuge i to minutter ved 30.000 ganger G ved fire grader Celsius for å fjerne lysatet, og samle supernatanten. Overfør 200 mikroliter av supernatanten til et mikrosenterrør for total RNA-analyse og 700 mikroliter til et mikrocentrifugerør for immunrensing. Fordøye den tidligere separerte totale RNA-prøven ved hjelp av 10 enheter RNase I i 25 minutter ved fire grader Celsius på et roterende blandestativ ved 30 rotasjoner per minutt.
Forbered sukroseputemesterblandingen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Last deretter prøven på 400 mikroliter av sukroseputen og sentrifugen i 90 minutter ved 245 000 ganger G og ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten raskt med en vakuumpumpe og overleggspellets med 150 mikroliter lysisbuffer.
Sikre prøven med parafininnpakning og resuspender pellets ved å riste i en time ved fire grader Celsius ved 300 rotasjoner per minutt. Vask 100 til 400 mikroliter av affinitetsbindingsmatrisen per prøve tre ganger med en milliliter lysisbuffer ved å bruke affinitetsmatrisen i lysisbufferen på nytt. Roter deretter ved 30 rotasjoner per minutt med et roterende blandestativ ved fire grader Celsius i fem minutter.
Utfelling ved sentrifugering. Kast den øvre væsken og gjenta denne prosessen tre ganger. Tilsett affinitetsbindingsmatrise i den tidligere separerte immunrensingsprøven og fordøye den ved hjelp av RNase I.Rotate i 25 minutter ved 30 rotasjoner per minutt og fire grader Celsius med et roterende blandestativ for å binde proteinet til affinitetsmatrisen.
Klargjør hovedblandingen for vaskebufferen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Vask affinitetsbindingsmatrisen med en milliliter vaskebuffer i omtrent ett minutt, roterende i blandestativet. Deretter utfelles ved sentrifugering ved 3000 ganger G i 30 sekunder ved fire grader Celsius og kast den øvre væsken.
Gjenta tre ganger. Vask to ganger til i en milliliter vaskebuffer, hver gang i fem minutter, roterer i blandestativet. Utfelling igjen ved sentrifugering.
Bruk 50 mikroliter perler for protein elution med samme mengde 2X prøvebuffer. Sentrifuge å pellet perlene og kaste den øvre væsken. Elute med 700 mikroliter 10 millimolar Tris.
Frys deretter i flytende nitrogen. Fjern prøven fra flytende nitrogen og oppbevar ved minus 80 grader Celsius som skal brukes til etterfølgende RNA-ekstraksjon. Vurder suksessen til affinitetsrensingen trinnvis av vestlig blot eller Coomassie-farging med aliquots av hvert trinn ved hjelp av mock IP på en ikke-tagget, villtype belastning som en kontroll for ikke-spesifikk binding til affinitetsmatrisen.
Vestlige blot resultater etter affinitetsrensing viste suksessen til det taggede proteinuttrykket. Isolering av ribosombeskyttede fotavtrykk ble validert ved hjelp av resultatene fra bioanalysen. Mens du genererer et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering og big data-analyse, fører undersykling til lav avkastning.
Men med dNTPene fortsatt til stede, fortsetter reaksjonen, og genererer lengre PCR-artefakter med chimeriske sekvenser på grunn av PCR-produkter som grunner seg selv. Det genererte biblioteket ble ytterligere validert av høysensitiv DNA-elektroforese for eksakt størrelsesfordeling og kvantifisering. Sekvensbiblioteket ble trimmet for adaptere og strekkoder, og de resulterende lesningene ble delt inn i forskjellige grupper av kodesekvenser, introner og intergene sekvenser.
Ribosomeprofiler som analyserer samoversettelsesinteraksjoner av Vma2p med ribosom-assosiert anstand SSB1p, Pfk2p og Fas1p, vises her med den eksperimentelle ordningen for hver affinitetsrensing. Det var ribosom-belegg langs den åpne leserammen av totale translatomer sammenlignet med SSB1, Pfk2p og Fas1p interaktivitet. Gjennomsnittlig berikelse av Ssb1p, Pfk2p og Fas1p ved hver ribosomeposisjon langs den åpne leserammen vises her.
Denne metoden muliggjør identifisering og karakterisering av de ulike kooversettelsesinteraksjonene, sikrer en funksjonell proteom, samt studiet av ulike sykdommer. Til dags dato er selektiv ribosomprofilering den eneste metoden som kan fange og karakterisere disse interaksjonene på en direkte måte in vivo.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
