Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) for å bestemme cellulær opprinnelse av radioaktivt signal
Chapters
Summary September 10th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) er et kraftig verktøy for å studere rollen til 18 kDa translokatorprotein eller Serotonin 5HT2A-reseptoruttrykk i Alzheimers sykdom i cellulær skala. Denne protokollen beskriver ex-vivo-applikasjonen av FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.
Transcript
Denne protokollen er komplementær til in vivo-avbildning. Det tillater celletype og cellulær nivå kvantifisering av radiotracers, som er en annen skala fra den som er oppnådd in vivo. Den største fordelen med denne teknikken er følsomheten og den cellulære oppløsningen gitt ved bruk av radioligands og cellesortering.
Slå på kameraet og last inn driftsprogramvaren. Klikk på Home XYZ-sceneknappen for å utføre homing. Sett opp eksperimentet som består av ett 10-minutters skanneanskaffelse.
Sett trinnmodusen til fin og anskaffelsesmodus til listmode for å registrere hele utslippsspekteret. Sett opp sengen og sørg for at varmesystemet, pustesensoren og anestesi er funksjonelle og sikre. Plasser deretter et fantom hvor dyrets hode skal plasseres.
Angi skanneområdet ved å skyve markørene for de tre dimensjonene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen. Forsikre deg om at skannevolumet til fantomet og dyret er det samme. Start fantomskanningen for senere kalibrering med de tidligere etablerte parameterne.
Sørg for å arbeide i et passende miljø, autorisert for eksperimenter som involverer radioaktivitet. Inkuber 100 mikrogram sideelvforløper i 100 mikroliter eddiksyre med natriumjodid og fem mikroliter 37% parastisk syre ved 70 grader Celsius i 20 minutter i en termocycler plassert i en hanskeboks. Fortynn reaksjonen ved hjelp av 50% acetonitril i vann for å nå et volum på 500 mikroliter.
Injiser de 500 mikroliter av den fortynnede reaksjonen på en omvendt fasekolonne. Isoler CLINDE med en lineær gradient HPLC kjøre fra 5 til 95% ACN i syv millimolar fosforsyre i 10 minutter. Fortynn isolasjonen i vann for å oppnå et sluttvolum på 10 milliliter og injiser deretter den fortynnede reaksjonen på en konsentrasjonskolonne.
Elute CLINDE fra kolonnen med 300 mikroliter absolutt etanol og fordamp deretter etanol ved å inkubere det i en vakuum sentrifuge ved romtemperatur i 40 minutter. Fortynn restene som inneholder CLINDE i 300 mikroliter saltvann for å skape en lagerløsning. Etter å ha målt radioaktiviteten, fortynn lagerløsningen i saltvann for å oppnå en løsning på 0,037 megabecquerel i 500 mikroliter.
Etablere kalibreringskurvene med kalde referanseforbindelser og løse den lineære regresjonsligningen: Y lik AX pluss B for å oppnå A- og B-koeffisienter. X representerer massen av kald forbindelse, og Y representerer området under kurvene. Kontroller området under kurven på radioligog, måler ultrafiolett absorbans ved 450 nanometer basert på kalibreringskurven og området under kurven til radioliganden.
Estimere massen og måle aktiviteten til radioliganden. Sørg for at den spesifikke aktiviteten er større enn 1000 gigabecquerel per mikromole. Klikk på Oppdater bilde-knappen for å oppdatere dyreposisjonen.
Angi skanneområdet ved å skyve markørene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen for de tre dimensjonene. Sett opp eksperimentet på en 60-minutters skanning som utgjør 60 bilder på ett minutt. Bruk alle andre parametere som er definert til å begynne med, på nytt.
Injiser 500 mikroliter av den radioaktive radiotraceren og skyll deretter røret med 300 mikroliter sterilt 0,9% natriumklorid. Samtidig klikker du på Start anskaffelse for å starte skanningen. Åpne programvaren for rekonstruksjon av skanning, og åpne deretter datasettet, og se etter filnavnparameterfilen som er opprettet i mappen til skanningen.
Velg interesseisotoper. Vær oppmerksom på at parameteren for listemodus tillater valg av flere isotoper på dette trinnet. Angi de forskjellige rekonstruksjonsparametrene som voxelstørrelse, antall delsett og gjentakelser som beskrevet i manuskriptet.
Velg utdataformatet som NIFTI, og velg deretter Start SPECT-rekonstruksjon. Bruk en flat metallspatel og et barberblad for å dissekere hjernens interesseområder. Plasser vevet i et sentrifugerør med to milliliter og vei vevet som er oppnådd.
Legg prøvene i et sentrifugerør med to milliliter kalsium- og magnesiumfri HBSS og sentrifuger deretter ved 300 ganger G i to minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Tilsett 1900 mikroliter enzymblanding og inkuber den i 15 minutter ved 37 grader Celsius mens du agiterer rørene ved inversjon hvert femte minutt. Tilsett 30 mikroliter enzymblanding to.
Rør forsiktig med en 1000 mikroliterpipette frem og tilbake 30 ganger. Deretter inkuberer du blandingen i 15 minutter ved 37 grader Celsius mens du agiterer rørene ved inversjon hvert femte minutt. Bland forsiktig frem og tilbake med en 200-mikroliter pipette og deretter en 10-mikroliter pipette før du inkuberer blandingen i 10 minutter ved 37 grader Celsius for å fjerne vevet.
Filtrer cellene med en 70-mikrometer cellesil og tilsett 10 milliliter kalsium- og magnesiumfri HBSS. Sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. For myelintømming, resuspend pellet med 400 mikroliter av myelin fjerning buffer og deretter legge til 100 mikroliter av myelin fjerning perler før inkubering i 15 minutter ved fire grader Celsius.
Tilsett fem milliliter myelinfjerningsbuffer og sentrifuger 300 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Tilsett 500 mikroliter myelinfjerningsbuffer og plasser de suspenderte pelletsene i magnetfeltkolonnen. Vask kolonnen med en milliliter myelinfjerningsbuffer fire ganger.
Sentrifuge ved 300 ganger G i to minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Vortex kort for å fjerne cellene og legge til fem mikroliter av Fc Block CD32. Tilsett 100 mikroliter av blandingen av primære antistoffer av interesse og inkuber i 20 minutter ved fire grader Celsius.
Sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Flekk rørene opp ned på mykt papir. Virvel røret kort, legg deretter til 100 mikroliter av den sekundære antistoffblandingen og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.
Tilsett en milliliter myelinfjerningsbuffer og gjenta sentrifugeringen. Kast supernatanten og flekk rørene opp ned på mykt papir. Resuspend cellene i 250 mikroliter sterile PBS og fortsett direkte til cellesortering.
In vivo SPECT-skanningen av villrotter viste høyere binding av CLINDE på stedet for lipopolysakkaridinjeksjonen enn i hjernens kontra-laterale region. Ex vivo-prøvene som gjennomgikk fluorescensaktivert cellesortering av radioligogbehandlet vev, eller FACS-RTT, avslørte tilstedeværelsen av et høyere antall CLINDE-bindingssteder bare i mikroglia, og viste at den cellulære opprinnelsen til CLINDE-signalet i den ipsilaterale siden av hjernen var mikroglia. Økningen i translokatorprotein, eller TSPO-binding, ved 12 måneder hos TgF344-AD rotter var begrenset til astrocytter.
I 24 måneder gamle rotter ble økningen i TSPO-binding observert på grunn av både astrocytiske og mikrogliale endringer. Hos eldre TgF344-AD rotter viste striatal astrocytter en redusert tetthet på 5HT2AR sammenlignet med wild-type. En kortikale overekspressjon av TSPO ble observert i både astrocytter og mikroglia av AD-forsøkspersoner sammenlignet med alderstilpassede kontroller da FACS-RTT ble utført på humane AD postmortem-prøver.
Når du arbeider med radioaktivitet, følg instruksjonene for radiobeskyttelse og bruk egnet personlig verneutstyr. Deretter, etter prosedyren, sørg for å dekontamineres arbeidsmiljøet. Protein kvantifisering og genuttrykksanalyse kan enkelt gjøres etter denne prosedyren på isolerte cellepopulasjoner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
