Login processing...

Journal / Biochemistry /

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Måling av fettsyre β-oksidasjon i en suspensjon av nyisolerte musehpopatocytter

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Journal (Biochemistry)

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Journal (Biochemistry)

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Click here for the English version

Måling av fettsyre β-oksidasjon i en suspensjon av nyisolerte musehpopatocytter

Article DOI: 10.3791/62904-v • 11:03 min

September 9th, 2021 •

Schuyler D. Vickers*¹, Dominique C. Saporito*¹, Roberta Leonardi¹

¹Department of Biochemistry, School of Medicine, West Virginia University

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 9th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Fettsyre β-oksidasjon er en viktig metabolsk vei som er ansvarlig for å generere energi i mange forskjellige celletyper, inkludert hepatocytter. Her beskriver vi en metode for å måle fettsyre β-oksidasjon i nyisolerte primære hepatocytter ved hjelp av ¹⁴C-merket palmittsyre.

Transcript

Denne protokollen ble utviklet for å gi en robust metode for måling av total mitokondrie og peroksisom fettsyre beta-oksidasjon i primære mus hepatocytter. Bruken av intakte celler opprettholder organellets integritet og reguleringsmekanismene på plass. I tillegg minimerer analyse av nyisolerte hepatocytter endringer i genuttrykk med hensyn til opprinnelseslever.

Operasjonen kan være utfordrende. Du må være selvsikker, flittig og fokusert. Når kannasjonen er vellykket, prøv å slappe av, men vær oppmerksom og overvåk kvaliteten på perfusjonen.

For å starte prosedyren, spray magen og brystet til den bedøvede musen med 70% etanol. Bruk deretter tangene til å trekke opp huden og bukveggen nær bunnen av magen og kutt lateralt på hver side av midtlinjen og opp til membranen for å eksponere organene. Utsett den dårligere vena cava, eller IVC, ved å flytte tarmene til høyre side og forsiktig snu leverens lober opp.

Sett inn et lite sylindrisk objekt, for eksempel en nålehette, under baksiden av musen for å vippe IVC litt og lette kanyleringen. Etter å ha startet pumpen med buffer en med lavest hastighet, sett nålen inn i IVC. Klipp deretter portalvenen for å lindre trykket og tillate drenering av blod og perfusjonsbuffere.

Før du øker strømningshastigheten til syv ml per minutt. Perfuse leveren med varm buffer en og sørg for at linjen satt inn i røret som inneholder buffer man forblir kontinuerlig nedsenket for å unngå å introdusere luftbobler. Mens perfusjon oppstår, tilsett 130 mikroliter kollagenoppløsning for å buffere to, og bland ved pipettering med en serologisk pipette.

Ettersom volumet i røret som inneholder buffer en reduseres til omtrent fem ml, legger du sakte til fem ml buffer to for å buffere en ved å pipettere på siden av røret. Gjenta tilsetningen to ganger før du legger til den gjenværende bufferen to i røret. Stopp perfusjonen når ca. 5 til 10 ml buffer to er igjen i røret.

Sluk leveren og overfør den deretter til 100 ml kulturfat som inneholder 20 ml iskald buffer to. Under laminær strømningshette bryter du forsiktig levervevet fra hverandre ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett. Deretter legger du til omtrent 20 ml iskald M199-buffer til hepatocytterfjæringen og filtrerer den gjennom en 100-mikron cellesil ved hjelp av stempelet på en sprøyte for forsiktig å fremme frigjøring av ekstra hepatocytter fra de større leverstykkene.

Vask 100 ml kulturfatet og cellesilen med M199 buffer for å samle cellefjæringen til oppsamlingsrøret er fullt. Sentrifuger deretter suspensjonen på 50 x g i to minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten før du bruker hepatocyttpellets på nytt i 30 ml kaldt M199 ved å virvle.

Gjenta vasken én gang. Tine palmittsyren og bovint serumalbumin, eller BSA, løsninger før du forbereder substratblandingen for flere reaksjoner. Aliquot 13,5 mikroliter BSA-oppløsning per reaksjon i et mikrosenterrør.

Etter oppvarming av røret til 41 grader Celsius, tilsett en mikroliter av 200 mM palmitinsyreoppløsning per reaksjon. Virvel røret kraftig før og under inkubasjon ved 41 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å lette dannelsen av det oppløselige palmittsyre-BSA-komplekset. I løpet av denne tiden, aliquot 133 mikroliter av 1 M perklorsyre som vil bli brukt til å stoppe reaksjonene i separate 1,5 ml mikrocentrifuge rør.

Før du starter reaksjonene, aliquot og inkubere 485,5 mikroliter M199 buffer per reaksjon i et rør ved 37 grader Celsius for å fortynne det forberedte radioaktive BSA-palmittsyrekomplekset. Deretter dispenserer du 750 mikroliter M199 med eller uten hemmere i de separate 14 ml runde bunnrørene som prøvene. Under hepatocytvasktrinnene, 10 til 15 minutter før du starter reaksjonene, overfør rørene til et ristende vannbad satt til 37 grader Celsius ved 180 til 200 rotasjoner per minutt.

Hvis hepatocyttenes levedyktighet er minst 75%fullføre preparatet av substratblandingen ved å overføre 0,8 mikroliter karbon-14 palmitinsyre per reaksjon på mikrocentrifugerøret som inneholder den avklarte BSA-palmittsyreoppløsningen. Virvel før du returnerer røret til vannbadet ved 41 grader Celsius. Umiddelbart etter den endelige hepatocytt-resuspensionen, overfør 750 mikroliter av hepatocyttfjæringen til hver av de 14 ml runde bunnrørene i det ristende vannbadet ved hjelp av en ml pipette og virvel rørene kort ved lav hastighet før overføring til en inkubator, svimlende hvert tillegg med 30 sekunder.

Overfør en separat aliquot av hepatocytter til et 1,5 ml mikrosenterrør for å spinne på 3000 x g i fem minutter. Fjern supernatanten før du lagrer pellet ved minus 80 grader Celsius for å måle den totale mengden protein i prøven for å normalisere resultatene. Mens hepatocyttene er under pre-inkubasjon ved 37 grader Celsius, legg til det radioaktive BSA-palmittsyrekomplekset til det varme mediet for å holde på 37 grader Celsius til du er klar til å starte reaksjonene.

For å starte reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet og tilsett 500 mikroliter av substratblandingen til hepatocyttene. Virvel cellene med lav hastighet i fem sekunder før du går tilbake til vannbadet for å inkubere i 15 minutter. Start et sett med reaksjoner og stopp umiddelbart for å bestemme bakgrunnen radioaktivitet.

Overfør og sett til side dupliserte aliquots av 200 til 250 mikroliter av rester substrat blanding i 6 ml scintillation hetteglass for å utføre tellingen. For å stoppe reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet for å gjenopplive ved virveling med moderat hastighet og overfør deretter 400 mikroliter av hepatocyttfjæringen til mikrocentrifugerørene som inneholder perklorsyre. Hette og virvel straks rørene før du gjentar sekvensen for alle prøvene, svimlende med 30 sekunder.

Etter å ha spinnet ned de 1,5 ml mikrocentrifugerørene ved 13 000 x g i 10 minutter, overfør 300 mikroliter av supernatanten til et 6 ml scintillasjonsglass og tilsett 4 ml scintillasjonsvæske for å telle radioaktiviteten i prøvene og substratblandingen aliquots i en scintillasjonsteller. I studien ga leverperfusjonen 30 til 40 millioner celler per lever, med gjennomsnittlig levedyktighet på 80%Det ble også observert at senking av glukosekonsentrasjonen i fastinggruppen ikke hadde noen negativ effekt på utbyttet eller levedyktigheten til hepatocyttene. Hepatocytt suspensjonen, isolert fra matet og fastet mannlige mus, ble analysert for fettsyre beta-oksidasjonskapasitet i nærvær og fravær av etomoksir, en potent hemmer av CPT1 og mitokondriefettsyreoksidasjon.

Antallene per minutt, eller CPM, som er forbundet med bakgrunnsradioaktiviteten, varierer med batchen av palmittsyre. Imidlertid var CPM fortsatt betydelig lavere enn prøvene inkubert med substratblandingen. Hepatocyttene isolert fra de faste musene viser en robust økning i frekvensen av både mitokondrie og peroksisomal fettsyre betaoksidasjon.

Dataene ble videre studert for å bestemme hastigheten som palmittsyre oksideres i hepatocyttene isolert fra de matede og faste musene. Forhindre at bobler kommer inn i linjen. Hold nålen stødig under perfusjonen.

Vær forsiktig når du håndterer hepatocyttene. Hold dem i suspensjon når du dispenserer dem. Hepatocyttene isolert fra denne prosedyren kan brukes som en suspensjon for å analyse andre metabolske veier, for eksempel fettsyresyntese, eller de kan belagt for cellekultureksperimenter.

X

Simple Hit Counter