Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie
Chapters
Summary September 20th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Multiplex in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om tegelijkertijd de transcripten voor twee G-eiwit-gekoppelde receptoren en één transcriptiefactor in het gehele vagale ganglionaire complex van de volwassen muis te visualiseren. Dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen te genereren.
Transcript
Deze procedure is zeer gevoelig en maakt een visualisatie van verschillende transcripties met minimale achtergrond mogelijk. Deze methode kan nauwkeurige kaarten genereren van het transcriptionele profiel van zeer heterogene celtypen. De procedure wordt gedemonstreerd door mij en Johnson Bob-manuel, een onderzoekstechnicus in het laboratorium.
Begin met het verzamelen van de volledige vagale ganglionische massa van de acht weken oude muis van elke kant, met behulp van een ontleedbare scope en chirurgische instrumenten. Gebruik na onthoofding van de muis een kleine tang om het sternohyoïde en de omohyoïde spieren lateraal naar de luchtpijp te verwijderen om het achterhoofdsbeen bloot te leggen. Maak het hele gebied van spieren en weefsels vrij totdat de halsslagader, de vagus en hypoglossale zenuw en foramen magnum zichtbaar zijn.
Knip vervolgens de hele hypoglossale zenuw af met een kleine veerschaar. Zoek naar het nodose ganglion als een doorschijnende massa dicht bij het foramen magnum. Breek met een kleine schaar voorzichtig het achterhoofdsbeen.
Om het jugulaire ganglion verder bloot te leggen, lokaliseer je zwarte melanocyten aan het oppervlak van de jugular als visueel oriëntatiepunt. Wanneer de ganglionen worden gevonden, snijdt u de zenuwaanhechtingen tussen de vagale ganglionische massa en trekt u zachtjes aan het perifere uiteinde van de nervus vagus terwijl u tegelijkertijd het jugulaire ganglion naar de hersenstam snijdt met een kleine veerschaar voor de extractie van de hele ganglionische massa. Verwijder het bindweefsel, de ganglionaire massa en het vet dat aan de nervus vagus kleeft.
Het houden van ongeveer een halve centimeter van de nervus vagus om het hanteren en lokaliseren van monsters te vergemakkelijken. Plaats de remove op ganglia met behulp van een fijne tang in microcentrifugebuizen van 1,5 millimeter. En incubeer bij vier graden celsius in formaline gedurende 24 uur.
En dan met 30% sucrose gedurende 24 uur. Plaats na incubatie de ganglia in een druppel van een diameter van vier millimeter van een optimaal snijtemperatuurmedium op een stuk aluminiumfolie. En formuleer het monster op een bed van droogijs.
Snijd de bevroren monsters met een cryostaat in secties van 14 micrometer dikte bij min 20 graden Celsius en verzamel de gesneden secties op de glazen microscoopglaasjes als drie series 42 micrometer uit elkaar. Spoel de dia's af met weefselsecties in PBS. En bak 30 minuten op 60 graden Celsius in een bakoven.
Plak vervolgens de dia's in 4% formaline gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Droog de glaasjes serieel uit in 50%70% en 100% ethanol gedurende elk vijf minuten. En breng waterstofperoxide-oplossing gedurende 10 minuten aan op de monsters voordat u in dubbel gedestilleerd water spoelt.
Voor In situ hybridisatie, of ISH, behandel de monsters met het doel-ophaalreagens gedurende vijf minuten. Spoel de monsters vervolgens achtereenvolgens in dubbel gedestilleerd water en 100% ethanol, gevolgd door luchtdroging. Maak met behulp van een hydrofobe pen een barrière rond de monsters.
Terwijl de monsters gedurende 30 minuten worden behandeld met protease bij 40 graden Celsius en een hybridisatieoven, verwarmt u de sondes voor op 40 graden Celsius en koelt u ze voor gebruik af op kamertemperatuur. Na het verplaatsen uit de oven, incubeer de dia's met de gewenste combinatie van doelsondes gedurende twee uur bij 40 graden Celsius in een hybridisatieoven. Incubeer negatief controleweefsel met het dihydrodipicolinate-reductase of DapB, doel C1-sonde gedurende twee uur bij 40 graden Celsius.
Spoel de glaasjes in wasbuffer en bewaar een nacht in vijf keer natriumcitraat bij kamertemperatuur. Spoel de volgende dag de glaasjes af met wasbuffer voordat u ze incubeert met versterkingsreagentia. En behandel met kanaalspecifieke reagentia zoals beschreven in het manuscript.
Was de dia's gevolgd door een behandeling met DapB gedurende 30 seconden. Breng vervolgens onmiddellijk het bevestigingsmedium op elke dia aan en plaats een afdekslip over het weefselgedeelte. Houd de weefsels horizontaal in een diahouder op vier graden Celsius totdat ze worden afgebeeld.
Bereid een confocale microscoop voor op beeldvorming door de vereiste parameters in te stellen. Verkrijg de afbeeldingen met een lijngemiddelde van vier en een pixelgrootte van ten minste 1024 bij 1024 om de kwaliteit van de afbeeldingen te verbeteren. Zodra u tevreden bent met de acquisitieparameters, begint u met het verwerven van de afbeeldingen met dezelfde instellingen.
Wijs valse kleuren toe aan elk kanaal om visualisatie te vergemakkelijken. Gebruik de digitale afbeeldingen om cellen te tellen door de omtrek van RNA-scopepositieve profielen te identificeren met één kern die licht gekleurd is met DapB. Bereken het percentage RNA-scopepositieve profielen dat elk transcript tot expressie brengt.
De optimale acquisitieparameters werden voor elke laser gekozen op basis van de niet-specifieke fluorescentie verkregen in het negatieve controleweefsel. De endogene fluorescentie in het nodose ganglion van een jongvolwassen muis is minimaal. En incubatie met een DapB-sonde, het resulteerde niet in signalen.
Bij verhoogd vermogen laser en versterking met de 488 nanometer laser, ongewenste achtergrond en willekeurige fluorescerende stippen verschijnen. De RNA scope-techniek werd toegepast om drie genen te detecteren in weefselsecties van de vagale ganglionaire massa. Het weefselprofiel was positief voor GHSR en CCK1R.
Het profiel omvatte zowel Phox2b- als CCK1R-transcripties in het rostrale deel van het nodose ganglion. Als gevolg van de multiplex ISH in nodose afferente neuronen, phox2b signalen specifiek opgehoopt in afferente neuronen, gelegen in de nodose ganglion. CCK1R-signalen hebben veel neuronen in het nodose ganglion intens gelabeld.
Bij lage vergroting konden cellen die lage CCK1R- of GSHR-signalen tot expressie brachten niet gemakkelijk worden waargenomen. DapB hielp het weefsel te visualiseren en vagale afferente neuronen met een grote en licht bevlekte kern te identificeren. Bij hoge vergroting zijn Phox2b positieve profielen duidelijk.
Profiel twee en drie zijn Phox2b-cellen met hoge en matige CCK1R-signalen. Profiel vier drukte zowel GHSR als CCK1R uit. Als gevolg van de multiplex ISH van de jugulaire afferente neuronen, kon het PRDM12-transcript specifiek worden gezien in afferente neuronen in het jugulaire ganglion.
Bij hoge vergroting werden matige signalen voor CCK1R gedetecteerd in profiel één en twee. Profiel drie is een vertegenwoordiger van PRDM12-cellen die negatief zijn voor CCK1R of GHSR. Consistentie van dissectie is een belangrijke factor.
Het is even belangrijk om te controleren of de parameters voor beeldvormingsacquisitie geen ongewenste achtergrondsignalen genereren. Multiplex In situ hybridisatie is uitgegroeid tot de gouden standaard in moleculaire gevestigde, vooral op het gebied van neuroanatomie. Deze methode kan gemakkelijk worden gecombineerd met immunohistochemie.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
