Please note that all translations are automatically generated.
Multiplex in situ hybridization (ISH) användes för att samtidigt visualisera transkriptioner för två G protein-kopplade receptorer och en transkription faktor i hela vagal ganglionic komplex av den vuxna musen. Detta protokoll kan användas för att generera exakta kartor över transkriptionsprofilerna för vagal afferenta nervceller.
Den här proceduren är mycket känslig och möjliggör en visualisering av flera transkriptioner med minimal bakgrund. Den här metoden kan generera exakta kartor över transkriptionsprofilen för mycket heterogena celltyper. Jag och Johnson Bob-manuel, forskningstekniker i laboratoriet, demonstrerar proceduren.
Börja med att samla hela vagal ganglionic massan från den åtta veckor gamla musen från varje sida, med hjälp av en dissekerande omfattning och kirurgiska instrument. Efter halshuggning av musen, använd små tångar för att ta bort sternohyoid och omohyoid musklerna lateralt till luftstrupen för att exponera occipital ben. Rensa hela regionen av muskler och vävnader tills halsartären, vagus och hypoglossal nerv och foramen magnum är synliga.
Skär sedan hela hypoglossala nerven med liten vårsax. Hitta för snar ganglion som en genomskinlig massa nära foramen magnum. Använd en liten sax och bryt försiktigt occipitalbenet.
För att exponera halsgängan ytterligare, lokalisera svarta melanocyter vid jugularens yta som ett visuellt landmärke. När ganglions hittas, skär nervfästena mellan vagal ganglionic massa och försiktigt dra på den perifera änden av vagusnerven samtidigt som man skär halskotdelagan mot hjärnstammen med små vårsaxar för extraktion av hela ganglionic massa. Ta bort den konjunktiva vävnaden, ganglionic massa och fett som fastnar på vagusnerven.
Hålla ungefär en halv centimeter av vagusnerven för att underlätta hantering och lokalisering av prover. Placera borttagningen till ganglier med hjälp av fina tångar i 1,5 millimeters mikrocentrifugerrör. Och inkubera vid fyra grader celsius i formalin i 24 timmar.
Och sedan med 30% sackaros i 24 timmar. Efter inkubation, placera ganglierna inuti en droppe med en fyra millimeter diameter av optimal skärtemperaturmedium på en bit aluminiumfolie. Och fras provet på en bädd av torr is.
Skär de frysta proverna med en kryostat i sektioner med 14 mikrometertjocklek vid minus 20 grader Celsius och samla de skurna sektionerna på glasmikroskopglasen som tre serier 42 mikrometer ifrån varandra. Skölj bilderna med vävnadssektioner i PBS. Och baka i 30 minuter vid 60 grader Celsius i en bakugn.
Postfixa sedan bilderna i 4% formalin i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Seriellt dehydrera bilderna i 50%70% och 100% etanol i fem minuter vardera. Och applicera väteperoxidlösning på proverna i 10 minuter innan du sköljer i dubbeldestillerat vatten.
För In situ-hybridisering, eller ISH, behandla proverna med målhämtningsreagenset i fem minuter. Skölj sedan proverna i dubbeldestillerat vatten och 100% etanol följt av lufttorkning. Använd en hydrofobisk penna och skapa en barriär runt proverna.
Medan proverna behandlas med proteas i 30 minuter vid 40 grader Celsius och en hybridiseringsugn, förkriga sonder vid 40 grader Celsius och kyl dem vid rumstemperatur före användning. Efter att ha flyttat från ugnen, inkubera bilderna med önskad kombination av målsonder i två timmar vid 40 grader Celsius i en hybridiseringsugn. Inkubera negativ kontrollvävnad med dihydrodipicolinatreduktas eller DapB, mål C1-sonden i två timmar vid 40 grader Celsius.
Skölj rutschkanorna i tvättbuffert och förvara i fem gånger saltsaltat natriumcitrat vid rumstemperatur över natten. Nästa dag skölj bilderna med tvättbuffert före inkubation med förstärkningsreagenser. Och behandla med kanalspecifika reagenser som beskrivs i manuskriptet.
Tvätta bilderna följt av behandling med DapB i 30 sekunder. Applicera sedan omedelbart monteringsmediet på varje bild och placera en täckglidning över vävnadssektionen. Håll vävnaderna horisontella i en glidhållare vid fyra grader Celsius tills avbildningen.
Förbered ett konfokalt mikroskop för avbildning genom att ställa in nödvändiga parametrar. Skaffa bilderna med en linje i genomsnitt fyra och en pixelstorlek på minst 1024 till 1024 för att förbättra kvaliteten på bilderna. När du är nöjd med förvärvsparametrarna börjar du förvärva bilderna med samma inställningar.
Tillskriva falska färger till varje kanal för att underlätta visualisering. Använd de digitala bilderna, utför cellräkning genom att identifiera konturen av RNA-scopepositiva profiler med en kärna lätt fläckad med DapB. Beräkna procentandelen positiva RNA-scopeprofiler som uttrycker varje transkription.
De optimala förvärv parametrarna valdes för varje laser baserat på ospecificerad fluorescens erhålls i den negativa kontroll vävnaden. Den endogena fluorescensen i snarans ganglion av en ung vuxen mus är minimal. Och inkubation med en DapB-sond resulterade inte i signaler.
Vid ökad effektlaser och förstärkning med 488 nanometerslaser visas oönskad bakgrund och slumpmässiga fluorescerande prickar. RNA omfattning teknik tillämpades för att upptäcka tre gener i vävnad delar upp av vagal ganglionic massa. Vävnad profilen var positiv för GHSR och CCK1R.
Profilen inkluderade både Phox2b och CCK1R-transkriptioner i den rostala delen av snar ganglion. Som ett resultat av multiplex ISH i snara afferenta nervceller, Phox2b signaler specifikt ackumuleras i afferenta nervceller, ligger i snar ganglion. CCK1R signaler intensivt märkt många nervceller i snar ganglion.
Vid låg förstoring kunde celler som uttrycker låga CCK1R- eller GSHR-signaler inte observeras lätt. DapB hjälpte till att visualisera vävnaden och identifiera vagal afferent nervceller med en stor och lätt färgade kärna. Vid hög förstoring är Phox2b positiva profiler uppenbara.
Profilerna två och tre är Phox2b-celler med höga och måttliga CCK1R-signaler. Profil fyra uttryckte både GHSR och CCK1R. Som ett resultat av multiplex ISH av jugular afferenta nervceller, PRDM12 transkriptet kunde ses specifikt ackumuleras i afferent nervceller ligger i jugular ganglion.
Vid hög förstoring upptäcktes måttliga signaler för CCK1R i profilerna ett och två. Profil tre är en representant för PRDM12 celler negativa för CCK1R eller GHSR. Konsekvens av dissekering är en viktig faktor.
Det är lika viktigt att kontrollera att parametrarna för avbildningsförvärv inte genererar oönskade bakgrundssignaler. Multiplex In situ hybridisering har blivit guldstandarden i molekylär etablerad, särskilt inom neuroanatomi. Denna metod kan enkelt kombineras med immunohistokemi.
