Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning af G Protein-koblet receptor udtryk i mus vagal afferent neuroner ved hjælp af Multiplex In Situ Hybridization
Chapters
Summary September 20th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Multiplex in situ hybridization (ISH) blev ansat til samtidig at visualisere udskrifter for to G protein-koblede receptorer og en transskription faktor i hele vagal ganglionic kompleks af den voksne mus. Denne protokol kan bruges til at generere nøjagtige kort over de transskriptionelle profiler af vagale afferent neuroner.
Transcript
Denne procedure er meget følsom og giver mulighed for en visualisering af flere udskrifter med minimal baggrund. Denne metode kan generere nøjagtige kort over den transskriptionelle profil af meget heterogene celletyper. Det vil være mig og Johnson Bob-Manuel, der er forskningstekniker i laboratoriet.
Begynd med at indsamle hele vagal ganglionic masse fra de otte uger gamle mus fra hver side, ved hjælp af en dissekering omfang og kirurgiske instrumenter. Efter halshugning af musen, skal du bruge små sammenkædning til at fjerne sternohyoid og omohyoid muskler lateral til luftrøret for at udsætte occipital knoglen. Ryd hele området af muskler og væv, indtil halspulsåren, vagus og hypoglossal nerve og foramen magnum er synlige.
Skær derefter hele hypoglossalnerven med lille fjedersaks. Find for nodose ganglion som en gennemsigtig masse tæt på foramen magnum. Brug lille saks, forsigtigt bryde occipital knoglen.
For at eksponere jugular ganglion yderligere, lokalisere sorte melanocytter på overfladen af halspulsåren som et visuelt vartegn. Når ganglions er fundet, skære nerve vedhæftede filer mellem vagal ganglionic masse og forsigtigt trække på den perifere ende af vagus nerve samtidig skære jugular ganglion mod hjernestammen med små fjeder saks til udvinding af hele ganglionic masse. Fjern det konjunktive væv, ganglionic masse og fedt klæber til vagus nerve.
Holde ca. en halv centimeter af vagus nerve til at lette håndtering og lokalisering af prøver. Placer fjernelse til ganglia ved hjælp af fine sammenkrimninger i 1,5 millimeter mikro centrifuge rør. Og inkubere ved fire grader celsius i formalin i 24 timer.
Og så med 30% saccharose i 24 timer. Efter inkubation skal du placere ganglieret inde i et fald på en fire millimeter diameter af optimal skæretemperaturmedium på et stykke aluminiumsfolie. Og sætning prøven på en seng af tøris.
Skær de frosne prøver med en kryostat i sektioner af 14 mikrometer tykkelse ved minus 20 grader Celsius og indsamle de afskårne sektioner på glasset mikroskop dias som tre serie 42 mikrometer fra hinanden. Skyl lysbillederne med vævssektioner i PBS. Og bages i 30 minutter ved 60 grader Celsius i en bageovn.
Derefter skal du anbringe diasene i 4% formalin i 15 minutter ved fire grader Celsius. Serielt dehydrere dias i 50%70% og 100% ethanol i fem minutter hver. Og påfør hydrogenperoxidopløsning på prøverne i 10 minutter, før de skylles i dobbeltdestilleret vand.
For In situ hybridisering, eller ISH, behandle prøverne med målet hentning reagens i fem minutter. Skyl derefter sekventielt prøverne i dobbeltdestilleret vand og 100% ethanol efterfulgt af lufttørring. Ved hjælp af en hydrofob pen, skabe en barriere omkring prøverne.
Mens prøverne behandles med protease i 30 minutter ved 40 grader Celsius og en hybridiseringsovn, forvarmes sonderne ved 40 grader Celsius og afkøles ved stuetemperatur før brug. Efter at have flyttet fra ovnen inkuberes diasene med den ønskede kombination af målsonder i to timer ved 40 grader Celsius i en hybridiseringsovn. Inkuber negativt kontrolvæv med dihydrodipicolinat reduktase eller DapB, mål C1 sonde i to timer ved 40 grader Celsius.
Skyl lysbillederne i vaskebufferen, og opbevar fem gange saltvandscitrat ved stuetemperatur natten over. Den næste dag skylles diasene med vaskebuffer før inkubation med forstærkning af reagenser. Og behandle med kanalspecifikke reagenser som beskrevet i manuskriptet.
Vask lysbillederne efterfulgt af behandling med DapB i 30 sekunder. Derefter straks anvende montering medium på hver dias og placere et dæksel glide over vævssektionen. Hold vævene vandrette i en glideholder ved fire grader Celsius indtil billeddannelse.
Forbered et konfokalt mikroskop til billeddannelse ved at angive de nødvendige parametre. Hent billederne med en linje i gennemsnit på fire og en pixelstørrelse på mindst 1024 i 1024 for at forbedre kvaliteten af billederne. Når du er tilfreds med anskaffelsesparametrene, skal du begynde at erhverve billederne ved hjælp af de samme indstillinger.
Tilskrive falske farver til hver kanal for at lette visualiseringen. Brug de digitale billeder til at udføre celletælling ved at identificere omridset af RNA-omfangspositive profiler med en kerne, der er let farvet med DapB. Beregn procentdelen af RNA-omfangspositive profiler, der udtrykker hver udskrift.
De optimale anskaffelsesparametre blev valgt for hver laser baseret på den uspecifikke fluorescens opnået i det negative kontrolvæv. Den endogene fluorescens i nodose ganglion af en ung voksen mus er minimal. Og inkubation med en DapB-sonde resulterede det ikke i signaler.
Ved øget effekt laser og gain med 488 nanometer laser, uønsket baggrund og tilfældige fluorescerende prikker vises. RNA-scope-teknikken blev anvendt til at opdage tre gener i vævsafsnit af vagal ganglionic masse. Vævsprofilen var positiv for GHSR og CCK1R.
Profilen omfattede både Phox2b og CCK1R udskrifter i rostral del af nodose ganglion. Som et resultat af multiplex ISH i nodose afferent neuroner, Phox2b signaler specifikt akkumuleret i afferent neuroner, placeret i nodose ganglion. CCK1R signaler intenst mærket mange neuroner i nodose ganglion.
Ved lav forstørrelse kunne celler, der udtrykker lave CCK1R- eller GSHR-signaler, ikke observeres let. DapB hjalp med at visualisere vævet og identificere vagale afferent neuroner med en stor og let farvet kerne. Ved høj forstørrelse er Phox2b positive profiler tydelige.
Profil to og tre er Phox2b-celler med høje og moderate CCK1R-signaler. Profil fire udtrykte både GHSR og CCK1R. Som et resultat af multiplex ISH af halspulsåren afferent neuroner, PRDM12 udskrift kunne ses specifikt akkumuleret i afferent neuroner placeret i jugular ganglion.
Ved høj forstørrelse blev der registreret moderate signaler til CCK1R i profil et og to. Profil tre er en repræsentant for PRDM12 celler negativ for CCK1R eller GHSR. Konsistens af dissektion er en vigtig faktor.
Det er lige så vigtigt at kontrollere, at parametrene for erhvervelse af billedbehandling ikke genererer uønskede baggrundssignaler. Multiplex In situ hybridisering er blevet guldstandarden i molekylær etableret, især inden for neuroanatomi. Denne metode kan nemt kombineres med immunohistochemistry.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
