Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning av G Protein-koblet reseptoruttrykk i mus Vagal Afferent Neurons ved hjelp av Multiplex In Situ Hybridization
Chapters
Summary September 20th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Multiplex in situ hybridisering (ISH) ble brukt til samtidig å visualisere transkripsjonene for to G protein-koblede reseptorer og en transkripsjonsfaktor i hele vagal ganglionic komplekset av den voksne musen. Denne protokollen kan brukes til å generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilene til vagal afferent nevroner.
Transcript
Denne prosedyren er svært følsom og tillater visualisering av flere transkripsjoner med minimal bakgrunn. Denne metoden kan generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilen til svært heterogene celletyper. Å demonstrere prosedyren vil være meg og Johnson Bob-manuel, en forskningstekniker i laboratoriet.
Begynn med å samle hele vagal ganglionic massen fra de åtte ukene gammel mus fra hver side, ved hjelp av et dissekeringsomfang og kirurgiske instrumenter. Etter halshugging av musen, bruk små tang for å fjerne sternohyoid og omohyoid muskler lateral til luftrøret for å eksponere occipital bein. Fjern hele regionen av muskler og vev til halspulsåren, vagus og hypoglossal nerve og foramen magnum er synlige.
Klipp deretter hele hypoglossalnerven med liten vårsaks. Finn for nodose ganglion som en gjennomsiktig masse nær foramen magnum. Bruk liten saks, bryt forsiktig occipitalbenet.
For å eksponere jugular ganglion videre, finn svarte melanocytter på overflaten av jugularet som et visuelt landemerke. Når ganglions er funnet, kutt nervefestene mellom vagal ganglionic massen og trekk forsiktig på den perifere enden av vagusnerven samtidig som du kutter jugular ganglion mot hjernestammen med liten vårsaks for utvinning av hele ganglionmassen. Fjern konjunktivt vev, gangitonisk masse og fett som stikker til vagusnerven.
Holde omtrent en halv centimeter av vagusnerven for å lette håndtering og lokalisering av prøver. Plasser fjern til ganglia ved hjelp av fine tang i 1,5 millimeter mikro sentrifugerør. Og inkuber ved fire grader celsius i formalin i 24 timer.
Og så med 30% sukrose i 24 timer. Etter inkubasjon, plasser ganglia inne i en dråpe med en fire millimeter diameter optimal skjæretemperaturmedium på et stykke aluminiumsfolie. Og uttrykk prøven på en seng med tørris.
Klipp de frosne prøvene med en kryostat i seksjoner på 14 mikrometer tykkelse ved minus 20 grader Celsius og samle kuttseksjonene på glassmikroskopet glir som tre serie 42 mikrometer fra hverandre. Skyll lysbildene med vevsseksjoner i PBS. Og bake i 30 minutter ved 60 grader Celsius i en stekeovn.
Deretter postfix lysbildene i 4% formalin i 15 minutter ved fire grader Celsius. Dehydrer lysbildene serielt i 50%70% og 100% etanol i fem minutter hver. Og påfør hydrogenperoksidoppløsning på prøvene i 10 minutter før du skyller i dobbelt destillert vann.
For In situ hybridisering, eller ISH, behandle prøvene med målhentingsreagenset i fem minutter. Skyll deretter prøvene sekvensielt i dobbelt destillert vann og 100% etanol etterfulgt av lufttørking. Bruk en hydrofob penn, lag en barriere rundt prøvene.
Mens prøvene behandles med protease i 30 minutter ved 40 grader Celsius og en hybridiseringsovn, forvarm sondene ved 40 grader Celsius og avkjøl dem ved romtemperatur før bruk. Etter å ha flyttet fra ovnen, inkuber lysbildene med ønsket kombinasjon av målsonder i to timer ved 40 grader Celsius i en hybridiseringsovn. Inkuber negativt kontrollvev med dihydrodipicolinate reduktase eller DapB, mål C1 sonde i to timer ved 40 grader Celsius.
Skyll lysbildene i vaskebufferen og oppbevar dem i fem ganger saltvannsnatriumsitrat ved romtemperatur over natten. Neste dag, skyll lysbildene med vaskebuffer før inkubasjon med forsterkningsreagenser. Og behandle med kanalspesifikke reagenser som beskrevet i manuskriptet.
Vask lysbildene etterfulgt av behandling med DapB i 30 sekunder. Påfør deretter monteringsmediet umiddelbart på hvert lysbilde og legg en dekselslipp over vevsdelen. Hold vevet horisontalt i en skyveholder ved fire grader Celsius til avbildning.
Klargjør et konfokalt mikroskop for avbildning ved å angi de nødvendige parameterne. Skaff bildene med en linjegjennomsnitt på fire og en pikselstørrelse på minst 1024 innen 1024 for å forbedre kvaliteten på bildene. Når du er fornøyd med anskaffelsesparametrene, begynner du å skaffe bildene ved hjelp av de samme innstillingene.
Tilskrive falske farger til hver kanal for å gjøre det enklere å visualisere. Bruk de digitale bildene til å utføre celletelling ved å identifisere omrisset av RNA-omfangspositive profiler med en kjerne lett farget med DapB. Beregn prosentandelen av positive RNA-omfangsprofiler som uttrykker hver transkripsjon.
De optimale anskaffelsesparametrene ble valgt for hver laser basert på den uspesifiserte fluorescensen oppnådd i det negative kontrollvevet. Den endogene fluorescensen i nodose ganglion av en ung voksen mus er minimal. Og inkubasjon med en DapB-sonde, det resulterte ikke i signaler.
Ved økt effektlaser og gevinst med 488 nanometerlaser, vises uønsket bakgrunn og tilfeldige fluorescerende prikker. RNA-omfangsteknikken ble brukt til å oppdage tre gener i vevsseksjoner av vagal gangionisk masse. Vevsprofilen var positiv for GHSR og CCK1R.
Profilen inkluderte både Phox2b- og CCK1R-transkripsjoner i rostraldelen av nodose ganglion. Som et resultat av multipleks ISH i nodose afferent neuroner, Phox2b signaler spesielt akkumulert i afferent nevroner, ligger i nodose ganglion. CCK1R-signaler merket intenst mange nevroner i nodose ganglion.
Ved lav forstørrelse kunne ikke celler som uttrykker lave CCK1R- eller GSHR-signaler observeres lett. DapB bidro til å visualisere vevet og identifisere vagal afferent nevroner med en stor og lett farget kjerne. Ved høy forstørrelse er Phox2b positive profiler tydelige.
Profiler to og tre er Phox2b-celler med høye og moderate CCK1R-signaler. Profil fire uttrykte både GHSR og CCK1R. Som et resultat av multiplex ISH av jugulære afferent nevroner, kan PRDM12-transkripsjonen ses spesielt akkumulert i afferent nevroner som ligger i jugular ganglion.
Ved høy forstørrelse ble moderate signaler for CCK1R oppdaget i profiler en og to. Profil tre er en representant for PRDM12 celler negativ for CCK1R eller GHSR. Konsistens av disseksjon er en viktig faktor.
Det er like viktig å verifisere at bildeinnsamlingsparametrene ikke genererer uønskede bakgrunnssignaler. Multiplex In situ hybridisering har blitt gullstandarden i molekylær etablert, spesielt innen nevroanatomi. Denne metoden kan enkelt kombineres med immunhiistokjemi.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
