Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

Fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi er en statistisk metode som bruker tidsresultatfluorescens for å finne den dynamiske signaturen til G-proteinkoblede reseptorer i levende celler. Her er vi spesielt interessert, i beta-2 adrenerge reseptorer. Sphingolipid reseptorer gir hovedsakelig informasjon om translasjonell diffusjonsdynamikk og ved hjelp av fluorescens anisotropi også rotasjonsdiffusjon.

Ved å introdusere en ekstra etikett, kan vi også pro-bindende eller til og med konformasjonsendringer hvis foster resonans energioverføring mellom etikettene som probed. Kvantitativ tid løst fluorescens krever nøye justering av oppsett- og kalibreringsmålingene. I de følgende minuttene vil vi gi en eksperimentell guide for livscellefluorescenskorrelasjonsspektroskopi, krysskorrelasjonsspektroskopi og Forster-resonansenergioverføring av G proteinkoblede reseptorer, ved hjelp av klone-i stand-koder og syntetisk strømningskraft.

Cellesitting og transfixing må utføres under sterile forhold. Legg en ren deksel slip barbell på en seks brønn kultur plate, og vask den ned med steril fosfat buffer saltvann legge til to ml cellekultur medium med fenol rød supplert med 10% foster bovint serum, 100 mikrogram, per amin penicillin og 100 mikrogram per ml streptomycin til hver brønn, og hold den til side. Ta CHO-cellene som dyrkes i samme medium med fenolrød ved 37 grader celsius i fem prosent CO2 og vask dem med fem ml PBS for å fjerne de døde cellene.

Tilsett to ml trypsin og inkuber i to minutter ved romtemperatur. Fortynn datacellene med åtte ml medium med fenolrød og bland forsiktig ved pipettering. Tell cellene i et Neubauer-kammer og sitt cellene med en tetthet på 150 000 celler per brønn i de seks brønnkulturplatene som inneholder dekkslippet.

La cellene vokse i en inkubator i 24 timer for å oppnå omtrent 80% samløp. Fortynn to mikrogram av ønsket vektor-DNA. For eksempel CT SNAP eller NT SNAP, og seks mikroliter av transfeksjonsreagenset i to separate rør.

Hver inneholder 500 mikroliter redusert serum medium for hver brønn og inkuberer dem i fem minutter ved romtemperatur. Bland de to løsningene sammen for å oppnå transfeksjonsblandingen og inkuber den i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden vasker du de sittende CHO-cellene en gang med steril PBS.

Erstatt PBS med en ml per brønn av fenolrødt fritt medium, supplert med 10% foster bovint serum og ingen antibiotika. Tilsett hele konstruksjonsblandingen av en ml dråpe klok til hver brønn og inkuber cellene over natten på 37 grader i fem prosent CO2. For merking, fortynn det aktuelle SNAP-substratet i ett ml medium supplert med 10% foster bovint serum for å oppnå en endelig konsentrasjon på ett mikromolar.

Vask de transfekterte cellene en gang med PBS og tilsett en ml per brønn av en mikromolar SNAP-substratløsning. Inkuber cellene i 20 minutter ved 37 grader i fem prosent CO2. Vask cellene tre ganger med fenol rødt fritt medium, og tilsett to ml per brønn fenol rødt fritt medium.

Inkuber cellene i 30 minutter ved 37 grader celsius i fem prosent CO2. Overfør dekselslippet til alle prøver deretter inn i bildekammeret og vask med 500 Microliter bildebuffer. Tilsett 500 mikroliteravbildningsbuffer før du går til FRED FCS-oppsettet.

FRED FCS-oppsettet er utstyrt med et konfokalt mikroskopivannmål, to laserlinjer, et tidsdylter enkelt utenlandsk tellesystem, to hybride BMTer og to aksjer for fotoninnsamling og datainnsamlingsprogramvaren. Det er svært viktig å justere oppsettet hver gang før måling i levende celler. For å justere fokus, pinhole og fargeposisjon, plasser to nanomolar grønn kalibreringsløsning på en glassdekselglidning og slå på 485 nanometer og 560 nanometerlaser som drives i hauger, sammenflettet eksitasjon eller PI-modus.

Fokuser på løsningen og juster pinhole- og krageringsposisjonen slik at den høyeste tellehastigheten og det minste konfektvolumet oppnås for å få maksimal molekylær lysstyrke. Gjenta denne prosessen for de røde kanalene med 10 nanomolar rød kalibreringsløsning og en blanding av begge deler. Plasser 10 nanomolar DNA-løsning på glassdekselglidning, og juster fokuset på pinhole og krageringsposisjonen slik at kryssfargene mellom de grønne og røde deteksjonskanalene er høyest.

Det er kilden til den høyeste amplituden. For målinger i levende celler, finn en passende celle ved å begrense med markørlampen og observere gjennom okulær. Slå på begge laserne i PI-modus og fokuser på membranen ved å se etter maksimalt antall per sekund.

Vær oppmerksom på at laserkraften kanskje må reduseres for celleprøvene. Helst mindre enn fem mikrowatt på målet. Dette avhenger sterkt av den brukte blomster og oppsettet.

Vær oppmerksom på auto- og krysskoll-kurvene til beta-2 AR bundet til EGP- og snap-tag-sonder i den elektroniske forhåndsvisningen av datainnsamlingsprogramvaren og samle inn flere sorteringsmålinger med en anskaffelsestid mellom 60 og 180 sekunder. Eksporter korrelasjonskurset og kontrasten fra alle målinger. Vær forsiktig her for å definere hurtig- og forsinkelsestidsvinduene riktig og bruke litt mikrotid for å få alternativ i datakorrelasjonsprogramvaren.

Totalt kreves det tre forskjellige korrelasjoner. Automatisk korrelasjon av tidsvinduet for den grønne kanalledeteksten. Automatisk korrelasjon mellom de røde kanalene og forsinkelsestidsvinduet.

Og til slutt krysskorrelasjonen til det grønne kanalsignalet, og det raske tidsvinduet var det røde kanalsignalet i forsinkelsestidsvinduet. Her er de automatiske korrelasjonsfunksjonene til den grønne og røde FRED for løsninger og passer dem til en 3 DT diffusjonsmodell med en ekstra trillingsbetingelse som kreves for å kalibrere formen og størrelsen på det konfokale deteksjonsvolumet for de to bruksfargekanalene, der B er kurvens grunnlinje og antall molekyler og fokus, TD diffusjonstiden og S, nullen over omega null formfaktoren til det konfekale volumelementet. Trilling blinker og fotofysikk er beskrevet som amplitude AR og avslapningstid TR. Bruk den kjente diffusjonskoeffisienten for den grønne og røde kalibreringen skiller seg ut og oppnå formfaktorer for å bestemme dimensjonene og volumet til det infektive konfektiske volumelementet.

Beregn spekteret på tvers av som IFR, det grønne fluorescerende signalet samlet på kanal nuller, og to inn i høyre deteksjonskanal, kanal en og tre, som et forhold mellom de innsamlede bakgrunnssignalene. Bestem den direkte forventningen til akseptorflyten av data av donoreksitasjonsbølgelengdene ved forholdet mellom bakgrunnsinnsamlet kontrast for de røde kalibreringsmålingene og den raske tidsvinduet som eksitasjon med grønn laser til bakgrunnen riktig konto rett i forsinkelsestidsvinduet excitation av rød laser. Beregn den molekylære lysstyrken til B både den grønne og røde strømningskraften basert på bakgrunnen samlet kontrast, og for å oppnå antall molekyler og fokus på 3 DT diffusjonsform.

Passer både ultrakorrelasjoner fra den grønne og røde kanalen, samt på tvers av korrelasjon fra den grønne ledeteksten og den røde forsinkelsen av det doble DNA-et til 3 DT-diffusjonsmodellen holder de oppnådde formede faktorene konstante for de automatiske korrelasjonsfunksjonene. Figurfaktoren for krysskorrelasjonsfunksjonene er vanligvis mellom disse to verdiene. Bestem amplituden ved null korrelasjonstid basert på skriftverdiene til det tilsynelatende antallet molekyler og fokus.

Beregn amplitudeforholdet for en prøve var en 100% ko-diffusjon av grønn og rød gulvkraft. Tilpass celleeksemplene til en passende modell. Hvordan de blir vist membranreseptor diffusjon ikke nysgjerrig på en bi-modal måte var en kort, ingen lang diffusjonstid.

I tillegg må fotofysikken og blinke ut gulvkraften vurderes. Her til TD1 og TD2, er de to som kreves for diffusjonstider. Og en er en brøkdel av den første diffusjonstiden I motsetning til kalibreringsmålingen der de frie terningene og DNA-trådene diffusjon, alle retninger, viser membranreseptorer bare 2D-diffusjon langs cellemembranene beregner konsentrasjonen av grønne eller røde etikettproteiner fra antall molekyler og fokus.

Og volumet av det konfiske volumelementet, ved hjelp av biasing masse. Tilpass de to altokorrelasjonene i den dobbeltmerkede prøven ved hjelp av samme modell som for enkeltnivåkonstruksjonen og krysskorrelasjonsfunksjonen ved hjelp av en to-modal diffusjonsmodell, Merknad for en global beskrivelse av systemet. Alle tre avlingene må passe sammen.

Diffusjonsbegrepet er identisk for alle tre avlingene. Og den eneste forskjellen er et omdømmetid faller, krysskorrelasjonsfunksjonen. Beregn konsentrasjonen av grønne eller røde arbeidsproteiner fra det respektive antall molekyler og fokus og volumet av det konfiske volumelementet.

Beregn fraksjonen eller konsentrasjonen av interagerende grønne og røde etikettproteiner fra celleprøvene ved hjelp av korreksjonsfaktorene hentet fra DNA-prøvene, amplitudeforholdene til celleprøven og de respektive oppnådde konsentrasjonene. Monter de to alterkorrelasjonene i FRED-prøven som en enkelt merket prøve og frontkorrelasjonen til en bi-modal diffusjonsmodell som inneholder et antikorrelasjonsbegrep, der AF gjenspeiler amplituden til den totale antikorrelasjonen og AR og TR den respektive amplituden og avslapningstiden. Ved antikorrelerte fluorescensendringer på grunn av FRED kan det være nødvendig med ett eller flere antikorrelasjonsvilkår, noe som resulterte i en dukkert av Fred cross korrelasjonsfunksjonen ved lave korrelasjonstider sammenfallende med en økning i de to autokorrelasjonsfunksjonene.

Kalibreringsmålingene av de grønne og røde blomsterløsningene til barberingsfaktorer på 6,5 og de grønne kanalene, og 6,8 i de røde kanalene. Dermed har det konfiske volumet størrelsen på 1,4 og 1,9 femto senere på denne måledagen, molekylets lysstyrke ligger på 12,5 kilohertz per molekyl og 2,6 kilohertz per molekyl. Vi har 15% av krysstale fra den grønne blomster for inn i de røde kanalene etter donoreksitasjon og 38% av direkte unntatt eksitasjon av den røde blomsterformen av greenen, fra vår DNA-måling, bestemmer vi korreksjonsfaktorene for det kondokale overlappingsvolumet til 0,6 og 0,7 også, cellene transfektert med enkeltetikettkonstruksjon viser to-modal todimensjonal diffusjon på cellemembranen der omtrent halvparten av molekylene diffuserer sakte på tidsskalaen på 50 til hundre millisekunder og den andre halvparten relativt rask rundt to millisekunder i begge konstruksjonene.

I tillegg er trilling blinker til stede. Men i det røde nivået snap konstruere en annen avslapningstid er anskaffet på 180 mikroseconds, som kan stamme fra Unbound snap rett. Fra selve dobbeltetiketten, transektert med anti-snap-konstruksjonen der de to etikettene på to forskjellige sider av cellemembranen, er to mindre målinger samlet opp støyen og den røde kappen til korrelasjon.

Og PI-krysskorrelasjonen er ganske høy her. Her 70% av molekylene, hvis du sakte under hundre millisekunder tidsskala, og bare 30% rask rundt ett millisekund, er brøkdelen av doble frigjørende molekyler lav og ligger mellom 15 og 25%Dataene for CT-snap ser bedre ut og det er mindre støyende. Imidlertid kan den forventede frontens dypeste antikorrelasjon ikke sees og er mest sannsynlig masse av den høye mengden krysstale, direkte aksept eksitasjon og trilling blinking av både blomsterkraft, og når dataanalyseordninger som drar nytte av den innsamlede fluorescensintensiteten, kan DKS bidra til å redde dette som vist for det simulerte datasettet.

Fordelen med Fred FCS-teknikken er at vi sammen med mobilitet kan undersøke konferansedynamikken til GPCRs. Det er imidlertid utfordrende å utføre FRED FCs i laboratorier og be om gode transfekterte celler, effektiv merking og et perfekt kalibrert oppsett. Bare en FRED par pro force er også veldig avgjørende.

Kritiske eksperimentelle trinn inkluderer optimalisering av transfeksjonsoptimalisering, minimering av bakgrunn og automatisk fluorescens. I tillegg vil Atoms analyserørledning bidra til å forstå de ulike dynamikkene i veiledere i levende celler. Vi håper at denne protokollen vil være nyttig for å utføre FRED FCS-tilnærmingen i live celleeksperimenter.