Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Omvendt genetisk tilnærming for å identifisere regulatorer av pigmentering ved hjelp av sebrafisk
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Regulatorer av melanocyttfunksjoner styrer synlige forskjeller i pigmenteringsresultatet. Dechiffrering av den molekylære funksjonen til kandidatpigmenteringsgenet utgjør en utfordring. Her demonstrerer vi bruken av et sebrafiskmodellsystem for å identifisere kandidater og klassifisere dem i regulatorer av melanininnhold og melanocyttnummer.
Transcript
Denne protokollen er en sammenslåing av ulike teknikker som vil gjøre det mulig for forskerne å avgrense rollen som kandidatgenet i melanocytbiologien. Det er en helhetlig tilnærming til å oppnå en logisk slutning. Ved å kombinere ulike metoder kan konfunderende faktorer unngås, og det kan hjelpe forskere med å få et betydelig resultat.
For å starte analysen, immobiliser de 48 HPF-embryoene med 0,016% tricaine. Monter embryoene med noen få milliliter 1,5 til 2% metylcellulose i en petriskål. Plukk embryoene med en Pasteur-pipette og legg dem i metylcellulose for å begrense bevegelsen under avbildning.
For optimal lateral eller dorsal avbildning, juster posisjonen med en forstørrelse på mer enn 5X. Plasser petriskålen under mikroskopet. Bruk en manipulator, juster fisken slik at alle fem melanocytt embryonale striper er synlige samtidig.
Bruk anskaffelsesprogramvaren til å ta bildene. Hvis fisken våkner, legg den i tricaine vann til den stabiliserer seg. Bruk det åpne verktøyet i ImageJ-programvaren til å åpne bildet som skal kvantifiseres.
Velg frihåndsformverktøyet for å disponere området som skal analyseres. Velg alternativet angi målinger, klikk på gjennomsnittlig grå verdi og deretter område. For å beregne gjennomsnittlig grå verdi for det valgte området, klikk på M eller gå for å analysere og velge mål.
Basert på scenen av interesse, overfør embryoene til en petriskål som inneholder 0,6 milligram per milliliter Pronase. Bruk en Pasteur-pipette til å overføre de dekorerte embryoene til en petriskål som inneholder vanlig embryovann etter fem til 10 minutter. Med en glass Pasteur pipette, samle og overføre rundt 100 embryoer til et to milliliter mikrosentrifugerør.
Kast mediet og tilsett 200 mikroliter iskald deyolking Ringers løsning. Legg røret på is og bland innholdet rundt 20 ganger med en pipette for å løse opp åket. Sentrifuger rørene ved 100 G i ett minutt ved fire grader Celsius to ganger, og kast supernatanten.
Overfør de deyolked embryoer ved hjelp av en milliliter pipette i en petriskål som inneholder 10 ml trypsinoppløsning. Bland løsningen en eller to ganger med en milliliter pipette for å redusere aggregeringen. Før den trypsiniserte suspensjonen gjennom en 70 mikrometer sil plassert på et 50 milliliter konisk rør for å samle en enkeltcellesuspensjon.
Vask petriskålen med den trypsiniserte suspensjonen for å fjerne de vedheftede cellene fra overflaten. For å telle de fluorescerende merkede cellene ved hjelp av et flowcytometer, tegner du et spredningsplott fremover mot side etter å ha opprettet en ny eksperimentmappe. Lag et histogram for intensiteten av fluoresceinisotiocyanat.
Last inn villtypecellene først for å angi forover- og sidespredningsportene og FITC-terskelen. Etterpå laster du cellene isolert fra transgene FTYRP GFP-linjeembryoer for å telle melanocyttene. Monter embryoene i 1,5 til 2% metylcellulose i en petriskål.
Plasser den under mikroskopet og juster den i ønsket retning ved hjelp av en pipettespiss. Bruk anskaffelsesprogramvaren til å skaffe bildene. For embryoer mindre enn 24 HPF, ved hjelp av 10X forstørrelse, ta hele bildet, mens for embryoer over 24 HPF, få flere skannefelt og deretter sette dem sammen.
Etter å ha utført analysen, avslørte Brightfield-avbildningen etter 48 timer tilstedeværelsen av alle fem pigmenterte melanophorstriper. På 48 HPF-stadiet ble antall laterale melanophorer beregnet, og det ble funnet at histonvarianten h2afv-morfanter viste et redusert antall melanophorer sammenlignet med kontrollen. Den gjennomsnittlige gråverdien ble målt for CA14- og h2afv-morfanter, som viste at verdiene var høyere for variantene enn kontrollmorfantene.
Ved å benytte en natriumhydroksydbasert spektrofotometrisk absorpsjonsmetode ble melanininnholdet kvantifisert der CA14-morfantene viste mindre innhold enn kontrollmorfantene. Fluorescensavbildning ble utført for å evaluere morfolinobasert endring for ulike stadier av sebrafiskens melanophorutvikling. Antall melanophorer i CA14 og h2afv morphants ble analysert ved hjelp av FACS.
Det ble observert at antall melanophorer i CA14 forble uendret, mens de var signifikant redusert i h2afv sammenlignet med kontrollmorfanten. Den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten per område ble også beregnet, noe som viser at h2afv-morfantene viser en betydelig reduksjon i verdien i forhold til kontrollmorfanter. Mens du justerer fisken før avbildning, må du sørge for at du kan visualisere alle fem melanophorstripene.
Du må vippe fisken litt for å skille mellom de to sidestripene. Etter å ha etablert rollen til et kandidatgen i melanocyttutvikling, kan vi eliminere genet på en vevsspesifikk måte ved hjelp av CRISPR-teknologi. Det vil være en mer målrettet tilnærming.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
