Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Omvänd genetisk metod för att identifiera regulatorer av pigmentering med zebrafisk
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Regulatorer av melanocytfunktioner styr synliga skillnader i pigmenteringsresultatet. Att dechiffrera den molekylära funktionen hos kandidatpigmenteringsgenen utgör en utmaning. Här demonstrerar vi användningen av ett zebrafiskmodellsystem för att identifiera kandidater och klassificera dem i regulatorer av melanininnehåll och melanocytantal.
Transcript
Detta protokoll är en sammanslagning av olika tekniker som skulle göra det möjligt för forskarna att avgränsa kandidatgenens roll i melanocytbiologin. Det är ett holistiskt tillvägagångssätt för att uppnå en logisk slutsats. Genom att kombinera olika metoder kan förvirrande faktorer undvikas och det kan hjälpa forskare att få ett betydande resultat.
För att påbörja analysen, immobilisera de 48 HPF-embryon med 0,016% tricaine. Montera embryon med några milliliter 1,5 till 2% metylcellulosa i en petriskål. Plocka embryon med en Pasteur-pipett och placera dem i metylcellulosa för att begränsa rörelsen under avbildning.
För optimal lateral eller dorsal avbildning, justera deras position med en förstoring på mer än 5X. Placera petriskålen under mikroskopet. Använd en manipulator, justera fisken så att alla fem melanocytembryonala ränder är synliga samtidigt.
Använd förvärvsprogramvaran för att fånga bilderna. Om fisken vaknar, placera den i tricaine vatten tills den stabiliseras. Använd det öppna verktyget i ImageJ-programvaran och öppna bilden som ska kvantifieras.
Välj verktyget för frihandsform för att skissera området för analys. Välj alternativet ställ in mätningar, klicka på medelgrått värde och sedan område. För att beräkna medelvärdet för det valda området, klicka på M eller gå till analysera och välj mått.
Baserat på scenen av intresse, överför embryon till en petriskål innehållande 0,6 milligram per milliliter pronas. Använd en Pasteur-pipett och överför de dekorionerade embryona till en petriskål som innehåller vanligt embryovatten efter fem till 10 minuter. Med en glaspasteurpipett, samla och överför cirka 100 embryon till ett två milliliter mikrocentrifugrör.
Kassera mediet och tillsätt 200 mikroliter iskall deyolking Ringers-lösning. Lägg tuben på is och blanda innehållet cirka 20 gånger med en pipett för att lösa upp oket. Centrifugera rören vid 100 G i en minut vid fyra grader Celsius två gånger och kassera supernatanten.
Överför de deyolked embryon med en en milliliter pipett i en petriskål innehållande 10 ml trypsinlösning. Blanda lösningen en eller två gånger med en pipett på en milliliter för att minska aggregeringen. För den trypsiniserade suspensionen genom en 70 mikrometer sil placerad på ett 50 ml koniskt rör för att samla en enda cellsuspension.
Tvätta petriskålarna med trypsiniserad suspension för att avlägsna de vidhäftade cellerna från ytan. För att räkna de fluorescerande märkta cellerna med hjälp av en flödescytometer, efter att ha skapat en ny experimentmapp, rita ett framåt- kontra sidospridningsdiagram. Gör ett histogram för intensiteten av fluoresceinisotiocyanat.
Läs in cellerna av vild typ först för att ställa in spridningsgrindarna framåt och på sidan och FITC-tröskeln. Ladda sedan cellerna isolerade från transgena FTYRP GFP-linjeembryon för att räkna melanocyterna. Montera embryon i 1,5 till 2% metylcellulosa i en petriskål.
Placera den under mikroskopet och justera den i önskad riktning med en pipettspets. Använd förvärvsprogramvaran för att skaffa bilderna. För embryon mindre än 24 HPF, med 10X förstoring, fånga hela bilden, medan för embryon mer än 24 HPF, förvärva flera skanningsfält och därefter montera dem.
Efter att ha utfört analysen avslöjade Brightfield-avbildningen efter 48 timmar närvaron av alla fem pigmenterade melanoforränder. Vid 48 HPF-stadiet beräknades antalet laterala melanoforer och det visade sig att histonvarianten h2afv-morfanter visade ett minskat antal melanoforer jämfört med kontrollen. Det genomsnittliga gråvärdet uppmättes för CA14- och h2afv-morfanter, vilket visade att värdena var högre för varianterna än kontrollmorfanterna.
Genom att använda en natriumhydroxidbaserad spektrofotometrisk absorptionsmetod kvantifierades melaninhalten där CA14-morfanterna visade mindre innehåll än kontrollmorfanterna. Fluorescensavbildning utfördes för att utvärdera morfolinobaserad förändring för olika stadier av zebrafiskmelanoforutveckling. Antalet melanoforer i CA14- och h2afv-morfanter analyserades med hjälp av FACS.
Det observerades att antalet melanoforer i CA14 förblev oförändrat, medan de var signifikant reducerade i h2afv jämfört med kontrollmorfanten. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten per område beräknades också, vilket visar att h2afv-morfanterna visar en betydande minskning av värdet i förhållande till kontrollmorfanter. När du justerar fisken innan du bildar, se till att du kan visualisera alla fem melanoforremsorna.
Du måste luta fisken lite för att skilja mellan de två laterala ränderna. Efter att ha fastställt rollen för en kandidatgen i melanocytutveckling kan vi eliminera genen på ett vävnadsspecifikt sätt med hjälp av CRISPR-teknik. Det kommer att bli en mer målinriktad strategi.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
