Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Generation af menneskelige motorenheder med funktionelle neuromuskulære vejkryds i mikrofluidiske enheder

Visualization of Amyloid β Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Journal (Neuroscience)

Visualization of Amyloid β Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Journal (Neuroscience)

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Click here for the English version

Generation af menneskelige motorenheder med funktionelle neuromuskulære vejkryds i mikrofluidiske enheder

Article DOI: 10.3791/62959-v

September 7th, 2021 •

Katarina Stoklund Dittlau^1,2, Emily N. Krasnow^1,2, Laura Fumagalli^1,2, Tijs Vandoorne^1,2, Pieter Baatsen^3,4, Axelle Kerstens^3,4, Giorgia Giacomazzi⁵, Benjamin Pavie^3,4, Elisabeth Rossaert^1,2, Jimmy Beckers^1,2, Maurilio Sampaolesi⁵, Philip Van Damme^1,2,6, Ludo Van Den Bosch^1,2

¹Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, ²VIB Center for Brain & Disease Research, Laboratory of Neurobiology, , ³VIB Center for Brain & Disease Research, Research Group Molecular Neurobiology, , ⁴VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, ⁵Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, ⁶Department of Neurology, University Hospitals Leuven

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 7th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en metode til at generere menneskelige motorenheder i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder ved at co-culturing human induceret pluripotente stamcelle-afledte motor neuroner med menneskelige primære mesoangioblast-afledte myotubes resulterer i dannelsen af funktionelt aktive neuromuskulære knudepunkter.

Transcript

Denne relativt enkle metode kan hjælpe forskning med fokus på motoriske neuroner og neuromuskulære knudepunkter i sundhed og sygdom. Denne protokol anvender standard stamcelleteknologi og kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder, hvilket øger reproducerbarheden. Afbrydelsen af motoriske neuroner og muskelceller er et tidligt fænomen i flere neuromuskulære sygdomme.

En simpel humaniseret model kan bidrage til at udvikle strategier til at modvirke dette fænomen. Vi bruger denne model til at undersøge den motoriske neuron lidelse, amyotrofisk lateral sklerose, men denne model kan også bruges til andre lidelser, hvor motorenheden er afgørende. Begynd med at overføre enheden ved hjælp af sammenkne fra forsendelsesbeholderen til petriskålen, der indeholder 10 milliliter på 70% til 100% ethanol til sterilisering i 10 sekunder.

Overfør enheden med sammenk tvinger til et stykke papir for at lufttørre i Laminar Flow i ca. 30 minutter. Når en enhed er tørret, skal du bruge sammenkædninger til at flytte hver enhed til en individuel 10 centimeter petriskål. For at belægge enheden med Poly-L-ornithine eller PLO skal du tilføje 100 mikroliter PLO-opløsning til toppen godt og observere væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt.

Tilsæt derefter 100 mikroliter PLO-opløsning til bunden godt, og gentag på den anden side af mikrosporene. Afslut ved at tilføje 100 mikroliter PLO-opløsning på den ene side for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrosporene. Inkuber i tre timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.

Efter tre timer skal enheden vaskes tre gange i fem minutter med DPBS. Coat enheden med 20 mikrogram per milliliter laminin og neurobasal medium ved at følge proceduren svarende til PLO belægning. Inkuber enheden natten over ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.

Den følgende dag skal du bruge en 200 mikroliter pipette og placere spidsen i brønden modsat kanalåbningen for at fjerne lamininbelægningen fra brøndene. Efter at have tilføjet DPBS til alle brønde, skal du lade enhederne med DPBS i Laminar Flow ved stuetemperatur til cellesåning. Skær SCM ark til størrelsen af enheden, mens du efterlader et par millimeter på hver side.

Efter sterilisering af enheder og SCM plader i en Petri parabol indeholder 10 milliliter af 70% til 100% ethanol i 10 sekunder, overføre enhederne med sammenkværn til en seks-brønd plade og SCM plader til en 10 centimeter Petri parabol til lufttørring i Laminar Flow. Anbring enheden på kanten, så alle sider kan tørre i ca. 30 minutter. Coat enhederne ved at tilføje en milliliter PLO-opløsning pr. brønd til hver enhed i seks-brøndspladen.

Sørg for, at enheden flyder oven på PLO-opløsningen med kanal- og mikrosporetsiden nedad i væsken. Coat SCM ark ved at tilføje 10 milliliter PLO opløsning til 10 centimeter Petri parabol, og bruge propeller til at skubbe ned SCM ark i væsken. Inkuber enheder og SCM-ark i tre timer som påvist tidligere.

Efter tre timer skal enhederne og SCM-arkene vaskes to gange i fem minutter med DPBS efterfulgt af endnu en vask i fem minutter med sterilt vand. Overfør derefter hvert SCM ark til en individuel 10 centimeter Petriskål til lufttørre. Mens du arbejder under et mikroskop i Laminar Flow, skal du bruge sammentrækninger til at montere silikoneenheden med kanalen og mikrosporet side ned i en 90 graders vinkel på SCM-arket, der sikrer, at alle sider er justeret.

Tryk let ned på enheden for at sikre, at du ikke kun forsegler yderkanter, men også omkring brønde, kanaler og mikrospor. For at belægge enheden med laminin, inde i Laminar Flow og under mikroskopet, tilsættes 100 mikroliter af 20 mikrogram pr. milliliteropløsning af laminin i top godt ved hjælp af en 200 mikroliter pipette. Overhold væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt uden lækage omkring brønden og kanalen.

Derefter tilsættes 100 mikroliter laminin-opløsning til bunden godt, gentag på den anden side af mikrosporene og afslut med yderligere 100 mikroliter laminin på den ene side for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrosporene og derefter inkubere enheden natten over. Den følgende dag skal du fjerne belægningen fra brøndene med 200 mikroliters pipetten ved at placere spidsen i brønden overfor kanalåbningen, efter at have tilføjet DPBS til alle brønde, lad enhederne med DPBS i Laminar Flow ved stuetemperatur til cellesåning. For at plade neurale forfædre celler eller NPC'er i den mikrofluidiske enhed, fjerne DPBS fra to brønde på den ene side af mikro riller i enheden ved hjælp af en 200 mikroliter pipette.

At frø i alt 250, 000 NPC'er og 60 til 100 mikroliter af dag 10 motor neuron medium per enhed, i øverste højre brønd, frø halvdelen af celle suspension tæt på kanalen åbning i en vinkel på 45 grader. Hold pause i et par sekunder for at lade celleaffjedringen flyde gennem kanalen, før du tilføjer den resterende halvdel af celleaffjedringen i den nederste brønd. Brug en pen til at markere den seedede side som NPC eller tilsvarende, for nem orientering af enheden uden et mikroskop, og inkubere i fem minutter for celle vedhæftet fil.

Dernæst langsomt fylde op de to NPC seedede brønde med en ekstra dag 10 motor neuron medium til et samlet volumen på 200 mikroliter per brønd. Brug en 200 mikroliter pipette, fjerne DPBS fra de to brønde på den anden side af mikro riller modsatte af frisksåede NPC'er. Tilføj 200 mikroliter af dag 10 motor neuron medier pr godt til de useedede brønde.

Tilsæt derefter seks milliliter DPBS pr. 10 centimeter skål omkring enheden for at forhindre fordampning af mediet under inkubation. For at ændre mediet skal du langsomt fjerne medier i begge brønde med NPC'er ved at placere 200 mikroliters pipettespids i den nederste kant af brøndvæggen overfor kanalåbningen. For at forhindre en stærk medium flow fra at beskadige cellerne på kanalen, langsomt tilføje 50 til 100 mikroliter af frisk motor neuron medium til hver brønd ved løbende at skifte mellem top og bund godt.

Gentag processen, indtil hver brønd indeholder 200 mikroliter af medium. På dag 17 af den motoriske neurondifferentiering skal du fjerne motor neuronmediet på den useedede side af mikrosporene i enheden med en 200 mikroliter pipette og vaske brøndene med DPBS. Seed i alt 200.000 menneskelige primære mesoangioblaster eller MABs, i 60 til 100 mikroliter af vækstmedium pr enhed ved såning halvdelen af celle suspension i top godt.

Pause i et par sekunder for at tillade celleaffjedringen at strømme gennem kanalen, før du sår den resterende halvdel af celleaffjedringen i bunden godt, som det tidligere blev demonstreret til plating af NPC'er. Inkuber enheden i fem minutter til celletilbehør. Derefter fyldes de to frisk MAB-seedede brønde med et ekstra vækstmedium og inkuberes igen som demonstreret.

For at indlede kemotaktik og volumetrisk gradient på den 21. dag i den motoriske neurondifferentiering skal du tilføje 200 mikroliters pr. brønd af motor neuron neurobasal medium, der indeholder vækstfaktorer til Myotube-rummet, og tilsæt derefter 100 mikroliters pr. brønd af motor neuron basal medium uden vækstfaktorer til det motoriske neuronrum. Det er vigtigt at vurdere cellelinjernes differentieringspotentiale, før de dyrkes sammen i mikrofluidiske enheder. Fusionsindekset for MBS blev fastlagt, og ca. 8% blev anslået til at være tilstrækkeligt til samkultur.

De genererede motor neuron kulturer var 85 til 95% positive for motor neuron markører. For at karakterisere og kvantificere mængden af neuromuskulære knudepunkter eller NMJs, antallet af co-lokaliseringer mellem motor neuron og præ-synaptiske markører neurofilament tung kæde og synaptofysin og postsynaptisk acetylen receptor markør alpha bungarotoxin, blev talt gennem hver sygdom stak og blev normaliseret på en række myosin-tunge kæde mærket Myotubes til stede i Z-stakken. NMJs optrådte som enkelt kontaktpunkt NMJs, hvor neurite berørte en klynge af en subtil cholin receptor på et interaktionspunkt.

Eller som flere kontaktpunkt NMJs, hvor en neurit pustet ud og engageret med en subtil cholin receptor klynge over en større overflade. Kvantificering af procentdelen af motor neuron innoverede Myotubes angivet, at ikke alle Myotubes indeholdt NMJs. Ved motor neuron aktivering med kaliumchlorid, calcium tilstrømning blev observeret i Fluo-4 mærket Myotubes, som bekræftede en funktionel forbindelse gennem til motor neuron neurit i Myotube, tilsætning af NMJ blocker d-tubocurarine, eller DTC til Myotube rummet resulterede i en hæmning af calcium tilstrømning.

For at få den største succes med denne model er det utroligt vigtigt at udføre en cellelinje kvalitetskontrol og for at undgå dannelsen af luftbobler i enhedens kanaler. Ved at kombinere det neuromuskulære kryds i en skål med andre IPC direkte celletyper efterligner endnu bedre in vitro-situationen, dette gør det også muligt at studere disse celletypers rolle.

X

Simple Hit Counter