Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Magnetisk isolasjon av mikroglialceller fra nyfødt mus for primære cellekulturer
Chapters
Summary July 25th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Primære mikrogliakulturer brukes ofte til å evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Denne protokollen beskriver en reproduserbar og relevant metode for magnetisk å isolere mikroglia fra nyfødte valper.
Transcript
Denne protokollen tillater oss å dyrke microglia under forhold som nøye etterligner in vivo-egenskapene. Ved hjelp av magnetisk cellesorteringsteknologi tillater protokollen oss å stimulere mikroglia bare to dager in vitro, uten å bruke serum i kulturmediet. For å begynne, bruk liten saks for å kutte huden fra nakken til nesen, etter sagittal sutur på 15 til 20 millimeter.
Sett spissene med foramen magnum parallelt med skallen. Klipp fra hver side til øynene. Klipp mellom øynene med liten saks for å løsne skallen og hjernen fra hodet.
Med to tang, ta tak i skallen nær olfaktoriske pærer, og riv skallen forsiktig. Med et barberblad, fjern lillehjernen og olfactive pære, og kutt hjernen i to stykker. Plasser hjernebitene i en petriskål som inneholder 40 milliliter HBSS uten kalsium og magnesium.
Forbered dissosiasjonsblanding i henhold til denne tabellen. Overfør 12 hjernestykker til et C-rør for en totalvekt på 1,2 gram per dissosiasjonsrør. Legg deretter C-rør på dissosieren med oppvarming.
Start det optimaliserte NTDK-programmet i dissociateren. Sentrifuge i 20 sekunder. Fullfør den mekaniske dissosiasjonen ved pipettering tre ganger.
Overfør cellene til fire 15 milliliter rør med vedlagte siler. Skyll silene med 10 ml HBSS med kalsium og magnesium. Sentrifuge i 10 minutter, og fjern supernatanten med en 10 milliliter pipette.
Tilsett forsiktig 10 ml HBSS med kalsium og magnesium, og suspendere pelleten på nytt. Igjen, sentrifuger og fjern supernatanten. Stopp pelleten på nytt med seks milliliter sorteringsbuffer.
Gjenta sentrifugeringen og kast supernatanten. Tilsett deretter 200 mikroliter CD11b mikroperleoppløsning og inkuber rørene i 15 til 20 minutter ved fire grader Celsius. Etter inkubasjon, suspendere pelleten med seks milliliter sorteringsbuffer.
Gjenta sentrifugeringen og heng pelleten på nytt med åtte milliliter sorteringsbuffer. Følg deretter Possel-programmet på separatoren for å forberede åtte kolonner. Pass cellene gjennom kolonnen ved å legge til en milliliter cellesuspensjon om gangen.
Med en milliliter sorteringsbuffer, eluere CD11b-positive celler på en steril elueringsplate. Samle cellene i et 50 milliliter rør. Sentrifuge og suspendere pelleten på nytt med 10 ml kaldt mikrogliamedium.
Tell de CD11b-positive cellene. Re-suspendere cellene i kaldt microglia medium for å få en endelig konsentrasjon på 650.000 til 700.000 celler per milliliter. Dispenser suspensjonen i cellekulturplater.
Inkuber platene over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Neste dag, erstatt mediet med forvarmet mikrogliamedium, og gjenta inkubasjonen over natten. Stimuler cellene før dette trinnet, og utfør fagocytisk analyse i løpet av de siste tre timene av stimuleringen.
Beregn antall perler i henhold til denne tabellen i forholdet 50 perler per celle. Forbered perleblandingen. Inkuber røret i en time i et vannbad ved 37 grader Celsius.
Vortex hvert 10. minutt. Til hver brønn, legg til det beregnede volumet av perleløsningen og inkuber i tre timer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble fagocytisk aktivitet av mikroglia evaluert etter stimulering av proinflammatoriske faktorer, som interleukin-1 beta, pluss interferon gamma eller lipopolysakkarider.
Etter stimulering i seks til 24 timer ble fluorescerende Cy3 microglia-perler analysert med konfokalt mikroskop. Etter seks timer begynner mikroglia å fagocytt Cy3 perler bare under interleukin-1 beta pluss interferon gamma tilstand. Etter 24 timer var det en økning av Cy3-fluorescens for begge typer stimulering, noe som fremhever økt fagocytisk aktivitet.
Renheten av mikrogliakultur ble forhøyet ved flowcytometri, som viste en økning i cellens levedyktighet etter sortering. Ved hjelp av flowcytometri og RT-qPCR-cellepopulasjonsmarkører ble analysert før og etter sortering av CD11b-positive celler fra musehjerner på barseldag åtte. Disse analysene skilte forskjellige hjernecellepopulasjoner, for eksempel CX3CR135 for mikroglia, O4 eller OLIG2 for oligodendrocytter, NeuN eller synaptophysin, for nevroner og ACSA-2, eller GFAP for astrocytter.
Etter cellesortering med CD11b-antistoff ble kun mikroglia oppnådd. Det er viktig å pipette veldig forsiktig mens du legger suspensjonen til kolonnen for å forhindre tilstopping og unngå mekanisk celledød. Etter denne metoden kan transkriptomisk proteomikk, som vestlig blod, eller Luminex, og til og med immunokjemi utføres for å se effekten av mikroglialstimulering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
