Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di analizzare il processo di arteriogenesi in vivo monitorando l’aderenza e lo stravaso delle cellule immunitarie nelle arterie collaterali in crescita in tempo reale. La tecnica di microscopia multifotonica consente la visualizzazione della dinamica cellulare nel tessuto profondo di modelli murini viventi con bassa fototossicità e con alta risoluzione spaziotemporale. La procedura al microscopio sarà dimostrata da Dominic van den Heuvel, un assistente tecnico della piattaforma di imaging multifotonico del laboratorio della dottoressa Helen Ishikawa-Ankerhold.

Dimostrerò la procedura chirurgica. Per iniziare, posizionare il topo anestetizzato in posizione supina. Quindi posizionare due pezzi di argilla modellata sotto l’arto posteriore superiore del topo per garantire una posizione piana del muscolo adduttore.

Posizionare il mouse sotto il microscopio stereo. Dopo aver rimosso i peli da entrambe le gambe, disinfettare e tagliare la pelle in un cerchio attorno alla cicatrice della precedente legatura dell’arteria femorale dell’arto posteriore destro. Rimuovere la pelle e lo strato di grasso dalla parte superiore della gamba e tirare da parte la pelle rimanente usando punti di sutura per creare una tasca attorno al muscolo adduttore con i vasi collaterali.

Successivamente, rimuovere il grasso sottocutaneo per ottenere una visione chiara del muscolo adduttore, dell’arteria e della vena profonde, nonché dei vasi collaterali. Rimuovere lo strato muscolare superficiale sopra i vasi collaterali usando una pinza fine. Riempire la tasca preparata con soluzione salina per evitare che il tessuto si asciughi e continuare la stessa procedura per l’arto posteriore sinistro finto operato.

Prima dell’imaging, aggiungere gel ad ultrasuoni in entrambe le tasche che impedisce l’asciugatura e funge da mezzo di immersione per l’accoppiamento ottico con l’obiettivo. Accendere la chiave della scatola laser in zaffiro di titanio, la scatola delle interfacce elettroniche, l’unità di riscaldamento della camera dell’incubatore, la lampada fluorescente e il computer. Avviare il software di acquisizione.

Impostare la lunghezza d’onda a 800 nanometri e aprire l’otturatore del microscopio. Nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione, scegliere la modalità strumento come raggio singolo e la modalità di misurazione come timelapse di scansione 3D. Quindi trasferire il topo anestetizzato nella camera di incubazione preriscaldata del microscopio e posizionare l’area con il gel ad ultrasuoni direttamente a contatto con la lente frontale dell’obiettivo.

Aprire l’otturatore del microscopio a epifluorescenza. Quindi scegliere un filtro adeguato o un’impostazione dicroica per la visualizzazione FTSE. Definire l’area di interesse seguendo il flusso sanguigno sotto l’illuminazione a epifluorescenza.

Dopo aver portato l’area di interesse nel campo visivo centrale, chiudere l’otturatore del microscopio a epifluorescenza. Nella finestra di dialogo dello scanner XY, impostare i parametri richiesti per dimensioni dell’immagine, pixel, frequenza, media delle linee. Regolare la potenza del laser e impostare il guadagno del moltiplicatore fotografico per i canali verde, rosso e blu.

Selezionare un obiettivo adeguato per l’imaging intravitale e le impostazioni di correzione della deriva. Definire l’intervallo della pila di immagini avviando la modalità di acquisizione dell’anteprima premendo il pulsante rosso nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione. Per ottenere buone immagini, definisci l’area e la struttura di interesse mettendo a fuoco.

Durante l’osservazione dello schermo, cambia messa a fuoco spostando l’obiettivo fino a quando l’immagine scompare e impostala come zero. Impostate la posizione dell’obiettivo come ultima posizione nella direzione assiale. Quindi cambia la messa a fuoco nella direzione opposta spostando l’obiettivo verso il basso fino a quando l’immagine scompare di nuovo dallo schermo.

Fare clic sul pulsante di arresto nell’angolo superiore sinistro della finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione e impostare la dimensione del passo su due micrometri. Scegliere l’asse Python come primo dispositivo asse nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione e selezionare Non attivare la modalità di salvataggio automatico. Quindi selezionare la casella di salvataggio automatico solo sull’asse temporale.

Quindi, premere l’icona Python nella finestra dei dispositivi disponibili per aprire la finestra di dialogo Python. Nelle impostazioni dell’asse della finestra di dialogo Python, immettere le sezioni da e a, quindi immettere il numero di passaggi. Passare alla finestra di dialogo XYZ stage Z e ingrandire l’intervallo di scansione di 200 micrometri su entrambe le estremità.

Per fare ciò, inserisci 200 micrometri all’inizio e inserisci meno 240 micrometri alla fine e l’intervallo verrà automaticamente impostato come meno 440 micrometri. Apri la finestra di dialogo front-end di VivoFollow. Avviare l’acquisizione delle immagini premendo la punta della freccia verde nell’angolo superiore sinistro della finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione.

Se si utilizza la correzione della deriva dinamica, cercare una finestra di dialogo per visualizzare la configurazione di correzione della deriva. Quindi imposta il canale di acquisizione utilizzato come riferimento di un punto di riferimento mobile. Immettete l’offset di correzione massimo in micrometri aggiunto alla prima e all’ultima posizione Z, quindi fate clic su OK. Monitorare l’offset di deriva corrente in X, Y e Z in tempo reale durante l’acquisizione dell’immagine nella finestra di dialogo front-end vivo flow e interrompere l’acquisizione dell’imaging dopo 35 minuti quando è necessario un altro ciclo di reiniezione di anestesia.

Iniettare mezza dose della miscela MMF e riavviare l’acquisizione dell’imaging fino al termine dell’esperimento. Questo strumento consente l’acquisizione di immagini a lungo termine, consente la raccolta di dati di alta qualità ed è adatto per tracciare le celle per le misurazioni della velocità. Come mostrato senza correzione della deriva, la regione di interesse si allontana progressivamente dalla vista di registrazione, influenzando la capacità di tracciare le celle per l’analisi della velocità.

Tuttavia, i filmati stabili possono essere registrati con il software di correzione della deriva e più celle possono essere monitorate per un lungo periodo. Il software di correzione della deriva può anche fornire una visualizzazione degli offset X, Y e Z nel tempo che è stato corretto dal sistema. La microscopia multifotonica offre un’elevata risoluzione spaziotemporale per il tracciamento dei leucociti in cui le fasi di migrazione cellulare e la velocità possono essere monitorate e monitorate.

Preparando i vasi collaterali per l’imaging multifotonico, è essenziale evitare danni alle arterie collaterali. Prima dell’imaging, è importante identificare in modo sicuro l’arteria collaterale corretta. Con questa nuova procedura di imaging multifotonico intravitale delle arterie collaterali, è possibile analizzare l’aderenza e lo stravaso di tutte le cellule del sangue in vivo modificando l’etichetta dell’anticorpo.