A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников
Chapters
Summary March 5th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Это исследование описывает прямое измерение производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников с использованием стабильного изотопного индикатора глюкозы через хвостовую вену как натощак, так и в богатых глюкозой состояниях в тандеме.
Transcript
Целью этой процедуры является определение производства глюкозы в печени при синдроме поликистозных яичников или мышиной модели СПКЯ. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением СПКЯ и является ключом к его патогенезу. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение.
В этом исследовании мы обсуждаем пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения M плюс два обогащения шести шести дейтерированных глюкоз, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии, масс-спектрометрии или GCMS. Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование установки катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии голодания, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкозы в обычном физиологическом растворе.
Для этого эксперимента измеряли выработку глюкозы во время голодания в условиях, богатых глюкозой, поэтому изотоп глюкозы готовили в двух разных препаратах. Индикатор получали в стерильных условиях путем растворения стерильных и не содержащих пирогенов шести шести дейтерированных глюкоз и стерильных 0,9% раствора натрия хлорида с глюкозой или без нее. Первый настой готовили только с помощью индикатора.
Второй инфузия содержала как индикатор, так и неизотопную глюкозу. После того, как растворы были приготовлены, их стерильно фильтровали фильтром 0,22 микрона и хранили при четырех градусах Цельсия. Растворы готовили таким образом, чтобы конечная доза инфузии была близка к одному миллиграмму на килограмм и минуту и двум миллиграммам на килограмм и минуту соответственно.
Для измерения скорости появления глюкозы во время базального состояния в богатом глюкозой состоянии использовалась средняя постоянная скорость инфузии шести шести дейтерированных глюкозы по 1,08 миллиграмма на килограмм и минуту и 1,9 миллиграмма на килограмм в минуту соответственно. Чтобы имитировать кормовое состояние, мы использовали среднюю скорость инфузии D-глюкозы 18,8 миллиграммов на килограмм с минутой во время состояния, богатого глюкозой. Выньте мышей из их домашних клеток и поместите их в клетки для голодания за три часа до начала эксперимента.
Для этого эксперимента мы использовали четырехмесячных самок мышей из штамма C57BL6J. Соберите оборудование для клетки, сгруппировав мышей в определенное количество мышей на инсулиновую помпу. Поместите перегородки поверх плоского, стабильного основания, чтобы сделать отдельные стойла для мышей.
Клетки прозрачные и сделаны из оргстекла. Есть плоское, устойчивое основание, на котором сидят перегородки. Дверь в клетку скользит, чтобы закрыться, и имеет выемку внизу, чтобы позволить хвосту пройти.
Соберите шприцы, содержащие один миллилитр базального инфузизата, затем подключите к трубке инфузионного насоса с помощью полиэтиленовой трубки. Подготовьте инфузионный насос, установив скорость до 150 микролитров в час, что является базальной нормой. Нагрейте водяную баню до 48 градусов по Цельсию.
Подготовьте станцию установки катетера, прилегающую к водяной бане, содержащую полудюймовые иглы 30 калибра, силастические трубки и однодюймовую прозрачную транспортную ленту. Выберите одну мышь и поместите ее в защищенный держатель с доступом к хвосту. Поместите кусок ленты на проксимальную часть хвоста, чтобы освободить место для введения катетера более дистально.
Подведите мышь к водяной бане и вставьте хвост на водяную баню примерно на 30-45 секунд. Это помогает расширить сосудистую систему хвоста для установки катетера. Установка катетера должна производиться в стерильных условиях.
Как только хвост нагреется, очистите хвост и поместите небольшой медный беззубый зажим аллигатора в качестве жгута на проксимальном конце хвоста. Визуализируйте боковую хвостовую жилку под увеличительным стеклом. Затем осторожно вставьте катетер в хвостовую вену, и аккуратно промойте раствор, чтобы обеспечить проходимость катетера.
Оберните кусок транспортной ленты вокруг места введения, чтобы закрепить катетер, и снимите небольшой жгут с хвоста. Поместите мышь в ее индивидуальную клетку и закройте раздвижную дверь, убедившись, что хвост выступает через выемку и остается за пределами клетки. Поместите дополнительный кусок ленты на весь катетер и хвост, чтобы закрепить его на опорной пластине клетки.
Отсоедините смыв от катетера хвостовой вены и поместите небольшой зажим на силастическую трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток при подключении инфузионной линии к насосу. После надежного соединения снимите зажим и промойте грунтовочный раствор, который состоит из настоя. Убедитесь, что раствор прозрачен в пробирке и не окрашен кровью.
Как только линии инфузии будут отмечены, что они функционируют должным образом, снимите крышку с мыши. Разместите стандартную постельную принадлежность вокруг мыши. Начните инфузию с инфузии, содержащей индикатор, и запускайте его в течение трех часов непрерывно.
На время инфузии продолжайте проверять самочувствие мышей, а также линии инфузии. Убедитесь, что инфузионная трубка надежно закреплена и что нет утечек из точек подключения линии. После завершения первой инфузии остановите инфузию и поместите зажим на трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток.
Осторожно удалил мышей из их вольеров, не нарушая катетер, чтобы собрать кровь. Для этого эксперимента мыши подверглись проколу щечных вен с использованием четырехмиллиметрового ланцета. Соберите примерно 75 микролитров крови в желаемый флакон.
Для депротеинизации образцов при подготовке к масс-спектрометрии добавляют примерно 15 микролитров крови к 500 микролитрам ацетона. Оставшаяся кровь может быть использована для проверки уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра и / или центрифуги для разделения плазмы для будущих гормональных анализов. Удалите инфузию из шприцевых насосов, отсоединив трубку от шприцев, и замените ее вторым инфузистом, содержащим индикатор вместе с глюкозой.
Повторите предыдущие этапы инфузии, используя богатую глюкозой изотопную инфузию глюкозы. Чтобы достичь устойчивого состояния, запускайте болюс второго инфузии по 600 микролитров в час в течение 15 минут. Обратите внимание на время начала для каждой группы клеток.
Уменьшите скорость инфузии до 150 микролитров в час, чтобы завершить три часа общего времени инфузии. Повторный забор крови, как описано ранее. Отсоедините инфузии, надавите на участки катетера до тех пор, пока кровотечение не прекратится, и верните мышей в их домашние клетки.
Далее образцы отправляются на GCMS. Рассчитать изотопное обогащение изотопа глюкозы при пике глюкозы С помощью GCCMS с использованием производного пентаацетата. Вкратце, этот метод включает в себя получение пентаацетатного производного глюкозы с последующим анализом образца с использованием GCMS в режиме положительной химической ионизации.
Селективный ионный мониторинг отношения массы к заряду, 171 к 169, выполняется для определения М плюс два обогащения изотопа глюкозы. Все кинетические измерения выполняются в стационарных условиях. Рассчитайте общую скорость появления глюкозы в плазме из M плюс два обогащения изотопа глюкозы и плазмы, используя установленные уравнения разбавления изотопов.
В установившихся условиях предполагается, что скорость появления глюкозы равна скорости исчезновения глюкозы. Скорость выработки эндогенной глюкозы равна общей норме глюкозы плазмы минус экзогенная глюкоза. В первую таблицу включены репрезентативные результаты исследования.
Все единицы выражаются в миллиграмме на килограмм и минуту. Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, была рассчитана общая норма глюкозы в плазме. В контрольной группе средний уровень глюкозы при появлении составил 19,98 в состоянии натощак.
В условиях, богатых глюкозой, показатель появления глюкозы составлял 25,8. Скорость производства глюкозы составила 19,08 в состоянии натощак и 8,56 в состоянии, богатом глюкозой. Аномальный метаболизм глюкозы и гомеостаз распространены при СПКЯ.
При нарушениях аномального метаболизма глюкозы нарушается регуляция подавления выработки глюкозы, что приводит к гипергликемии. В этом исследовании мы описываем простой способ измерения скорости производства глюкозы в печени у нескольких мышей одновременно. Важнейшими компонентами этого эксперимента являются введение катетера и определение точных измерений изотопа глюкозы и естественной глюкозы для адекватного выполнения GCMS.
Преимуществами исследования является выполнение инфузии минимально инвазивным способом за счет введения катетера хвостовой вены, а также использование легкодоступного, стабильного индикатора глюкозы. Существуют некоторые ограничения для исследования, в том числе техническая потребность в процедуре и потребность в возможных дополнительных навыках. В целом, мы описываем простой и точный способ измерения скорости общего производства глюкозы в печени в модели мыши с СПКЯ.
Этот метод может послужить основой для многочисленных исследований, включающих метаболизм глюкозы мышиных моделей.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
