Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.
Transcript
تم اتباع نهج بسيط لرصد التغيرات في البروتيوستاسيس من خلال تقييم تجميع البولي جلوتامين وتوفير إطار يمكن استخدامه للتطبيقات عالية الإنتاجية. يمكن أن يصبح تسجيل النمط الظاهري مثل عدد المجاميع بواسطة I ذاتيا. تتيح لنا أتمتة العد الكلي القضاء على هذا التحيز وزيادة الإنتاجية والتكرار.
تساعد هذه الطريقة على تحديد الجينات البكتيرية التي تساهم في اضطراب البروتينات المضيفة. سيساعدنا فهم مساهمة الجينات البكتيرية الفردية على فهم آثارها في التسبب في أمراض مثل الزهايمر وباركنسون وهانتنغتون. ابدأ بإزالة الألواح التي تحتوي على الديدان من الفريزر وتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة.
ثم امسح التكثيف الزائد وأزل الغطاء قبل التصوير. استخدم إعدادات المجهر مع وقت التعرض 500 مللي ثانية ، والتكبير 40 × مع محول الكاميرا 0.63 × ، وضبط كثافة GFP على 100٪ أثناء التقاط الصورة. الآن اضبط عناصر التحكم في الضوء المنقول حتى تظهر الديدان مضاءة بشكل ساطع مقارنة بالخلفية المظلمة ، وتجنب التعرض المفرط.
قم بتغيير مواضع الديدان داخل البئر لمنع التكتل المفرط باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لدفع الديدان بلطف إلى الموضع المطلوب. اضبط القناة على مرشح GFP لإنشاء مستوى بؤري لكلتا الصورتين. التقط صورة ميدانية ساطعة.
التقط صورة فلورية مقابلة دون إزعاج اللوحة أو تغيير تركيز المجهر. الآن لتقييم الصور ، قم أولا بتنزيل CellProfiler. افتح البرنامج ، واسحب الصور ذات الأهمية وأفلتها في مربع الصور.
انقر على الصور في قائمة الملفات لفتحها. حدد زجاج المكبر لتمييز منطقة ذات أهمية ورمز السهم لقياس طول كل من الديدان والمجاميع. مرر مؤشر الماوس فوق الكائن المطلوب لتحديد قيمة كثافته، والتي يمكن رؤيتها في الجزء السفلي من الشاشة.
للاستفادة من خط أنابيب تحليل الصور CellProfiler ، قم بتسمية أزواج الصور بشكل صحيح كما هو موضح في مخطوطة النص بعد تنزيل CellProfiler من الموقع الرسمي. قم بتنزيل خط الأنابيب وتحميله إلى CellProfiler عن طريق تحديد الملف والاستيراد وخط الأنابيب من الملف. حدد وحدة الديدان غير المتشابكة لفتح إعداداتها لتحميل مجموعة تدريب تستخدم لتحديد الديدان في وحدة الديدان غير المتشابكة.
ثم حدد اسم ملف مجموعة التدريب. حدد رمز تحميل الملف وقم بتحميل الملف التكميلي أيضا. قم بتحميل الصور عن طريق تحديد وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى.
ثم قم بسحب وإسقاط الصور المسماة بشكل صحيح. قبل تحليل الصور ، حدد مجلد الإخراج المطلوب الذي سيتم استخدامه لتخزين النتائج بالنقر فوق زر إعدادات الإخراج الموجود بالقرب من الزاوية السفلية اليسرى من البرنامج. ثم حدد رمز المجلد على يمين الإخراج الافتراضي لاختيار موقع الإخراج المطلوب.
حدد أيقونة تحليل الصور لبدء تحليل الصور. إذا استغرق التحليل وقتا طويلا لإكماله وتوقف في معالجة صورة واحدة ، فقم بإجهاض التشغيل وتحديد الصورة غير المعالجة عن طريق الفرز من خلال مجلد الإخراج ، وملاحظة اسم الصورة الذي لم يتم العثور عليه. بعد التحليل الكامل ، سيقوم البرنامج بتنظيم النتائج في جدول بيانات Excel يحتوي على ديدان فردية في العمود N ، وعدد المجاميع المعنية في العمود K.Download منظم بيانات التعريف لتنظيم البيانات بسهولة من ملف CSV الناتج من CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Windows ، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخراجه إلى الموقع المطلوب. حدد موقع المجلد المستخرج المسمى gui_Windowsos_64x وافتحه. وقم بتشغيل التطبيق من خلال النقر على أيقونة تطبيق واجهة المستخدم الرسومية.
قد يتم فتح مطالبة تطلب إذنا بالتشغيل. حدد المزيد من المعلومات ثم انقر فوق تشغيل على أي حال. منظم بيانات التعريف جاهز الآن لسحب وإسقاط ملفات CSV الناتجة عن CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Mac OS، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخرج ملف تطبيق منظم البيانات الوصفية للملف. افتح المجلد المستخرج الموجود في التنزيلات. انقر بزر الماوس الأيمن على تطبيق واجهة المستخدم الرسومية وحدد فتح.
ستظهر مطالبة تطلب الإذن بالفتح بسبب عدم وجود ترخيص رسمي. حدد فتح. بمجرد فتح تطبيق منظم البيانات الوصفية الخاص بك في نظام التشغيل المعني ، انقر فوق تحميل ملفاتك هنا ، أو اسحب وأفلت ملفات CellProfiler CSV المطلوبة.
انقر فوق الزر "تنظيم" ، والذي سيجلب المستخدم إلى شاشة جديدة باستخدام زر تنزيل الملفات. انقر فوق الزر وحدد الموقع المطلوب لحفظ ملف الإخراج. سيظهر ملف الإخراج كاسم الملف الأصلي مع إضافة ملحق _organized إلى اسم الملف.
في وجود FODR ، كان للديدان التي تم تغذيتها ببكتيريا مختلفة حجم جسم أكثر اتساقا مما سمح باكتشاف أكثر اتساقا ودقة للديدان ، وبالتالي حل مشكلة الاكتظاظ. أدى تجميد الديدان إلى تحسين اكتشاف الركام polyQ من خلال القضاء على التألق في الخلفية ، بالإضافة إلى دقة العد الآلي مقارنة بالعد اليدوي. تم استخدام إضاءة الحقل الساطع المقلوبة للكشف عن قناة C.elegans و GFP بأكملها لتصوير مجاميع polyQ YFP.
تم الكشف عن الدودة وفك تشابكها وتكميمها المجمعة لكل دودة من خلال تطبيق خط أنابيب محسن لمعالجة صور CellProfiler ، والذي يسمح بالحصول على عدد المجاميع لكل دودة فردية. كان الفرق بين فعالية القياس الكمي الكلي الآلي واستخدام خط أنابيب CellProfiler ضئيلا ، مما يشير إلى أنه يمكن تطبيق الطريقة الآلية على شاشات واسعة النطاق. من بين 90 سلالة بكتيرية تم اختبارها ، أظهر استعمار أمعاء C.elegans مع مرشح واحد انخفاضا كبيرا في عدد المجاميع.
كشفت تجارب التأكيد عن طريق العد اليدوي أن أيا من الطفرات ، بما في ذلك تلك التي خفضت بشكل كبير عدد المجاميع أثرت على تجميع polyQ. يجب على الباحثين الذين يقررون استخدام هذا الإطار أن يفهموا أن الخطوات الموضحة ليست مطلقة. يعد التعديل والفهم الأساسي لكيفية التعامل مع CellProfiler ضروريين للنجاح.
يمكن استخدام مناهج كيميائية حيوية إضافية مثل النشاف الغربي لتأكيد تجميع polyQ.
Tags
علم الأحياء ، العدد 176 ، C. elegans ، البروتيوستاسيس ، البولي جلوتامين ، التجميعRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
