Biology
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कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में कुल मात्रा का ठहराव स्वचालित करना
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निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रोटियोस्टेसिस में परिवर्तन के आकलन के रूप में पॉलीग्लूटामाइन समुच्चय को मापने के लिए कृमि संवर्धन, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और स्वचालित छवि प्रसंस्करण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो के विकास और अनुकूलन का वर्णन करता है।
Transcript
पॉलीग्लूटामाइन एकत्रीकरण का आकलन करके और एक ढांचा प्रदान करके प्रोटियोस्टेसिस में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक सरल दृष्टिकोण लिया गया था जिसका उपयोग उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। एक फेनोटाइप स्कोरिंग जैसे कि मैं द्वारा समुच्चय की संख्या व्यक्तिपरक बन सकता हूं। कुल गिनती को स्वचालित करने से हमें इस तरह के पूर्वाग्रह को खत्म करने, थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता बढ़ाने की अनुमति मिलती है।
यह विधि मेजबान प्रोटियोस्टेसिस व्यवधान में योगदान करने वाले जीवाणु जीन की पहचान करने में मदद करती है। व्यक्तिगत जीवाणु जीन योगदान को समझने से हमें अल्जाइमर, पार्किंसंस और हंटिंगटन जैसी बीमारियों के रोगजनन में इसके निहितार्थ को समझने में मदद मिलेगी। फ्रीजर से कीड़े युक्त प्लेटों को हटाकर शुरू करें और उन्हें कमरे के तापमान पर पिघलने दें।
फिर अतिरिक्त संक्षेपण को मिटा दें और इमेजिंग से पहले ढक्कन को हटा दें। एक्सपोजर समय 500 मिलीसेकंड के साथ माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें, 0.63 एक्स कैमरा एडाप्टर के साथ 40 एक्स का आवर्धन, और छवि कैप्चर के दौरान जीएफपी तीव्रता 100% पर सेट करें। अब प्रेषित प्रकाश नियंत्रण को समायोजित करें जब तक कि कीड़े अंधेरे पृष्ठभूमि की तुलना में उज्ज्वल रूप से प्रबुद्ध दिखाई न दें, ओवरएक्सपोज़र से बचें।
धीरे वांछित स्थिति में कीड़े धक्का करने के लिए एक 10 माइक्रोलीटर विंदुक टिप का उपयोग करके अत्यधिक क्लंपिंग को रोकने के लिए अच्छी तरह से कीड़े की स्थिति को बदलने। दोनों छवियों के लिए फोकल विमान स्थापित करने के लिए चैनल को जीएफपी फ़िल्टर पर सेट करें। एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि कैप्चर करें।
प्लेट को परेशान किए बिना, या माइक्रोस्कोप के फोकस को बदलने के बिना एक संबंधित प्रतिदीप्ति छवि लें। अब छवियों का आकलन करने के लिए, पहले सेलप्रोफ़ाइलर डाउनलोड करें। सॉफ़्टवेयर खोलें, और छवियों के बॉक्स में रुचि की छवियों को खींचें और छोड़ें।
उन्हें खोलने के लिए फ़ाइल सूची में छवियों पर क्लिक करें। ब्याज के एक क्षेत्र को उजागर करने के लिए आवर्धक ग्लास का चयन करें और कीड़े और समुच्चय दोनों की लंबाई को मापने के लिए तीर आइकन। इसकी तीव्रता मूल्य निर्धारित करने के लिए वांछित वस्तु पर होवर करें, जिसे स्क्रीन के निचले हिस्से पर देखा जा सकता है।
सेलप्रोफ़ाइलर छवि विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करने के लिए, आधिकारिक वेबसाइट से सेलप्रोफ़ाइलर डाउनलोड करने के बाद पाठ पांडुलिपि में वर्णित छवि जोड़े को ठीक से नाम दें। पाइपलाइन डाउनलोड करें और फ़ाइल से फ़ाइल, आयात और पाइपलाइन का चयन करके इसे सेलप्रोफ़ाइलर में अपलोड करें। अनटैंगल्ड वर्म मॉड्यूल में कीड़े की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रशिक्षण सेट को लोड करने के लिए अपनी सेटिंग्स खोलने के लिए अनटैंगल्ड वर्म मॉड्यूल का चयन करें।
फिर प्रशिक्षण सेट फ़ाइल नाम की पहचान करें। अपलोड फ़ाइल आइकन का चयन करें और पूरक फ़ाइल भी अपलोड करें। ऊपरी बाएं कोने में छवियों मॉड्यूल का चयन करके छवियों को अपलोड करें।
और फिर ठीक से नामित छवियों को खींचें और छोड़ें। छवियों का विश्लेषण करने से पहले, वांछित आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें जिसका उपयोग प्रोग्राम के निचले बाएं कोने के पास स्थित आउटपुट सेटिंग्स बटन पर क्लिक करके परिणामों को संग्रहीत करने के लिए किया जाएगा। फिर वांछित आउटपुट स्थान चुनने के लिए डिफ़ॉल्ट आउटपुट के दाईं ओर फ़ोल्डर आइकन का चयन करें।
छवि विश्लेषण शुरू करने के लिए विश्लेषण छवियों आइकन का चयन करें। यदि विश्लेषण को पूरा होने में बहुत अधिक समय लगता है और एक एकल छवि को संसाधित करने में अटक जाता है, तो रन को निरस्त करें और आउटपुट फ़ोल्डर के माध्यम से सॉर्ट करके असंसाधित छवि की पहचान करें, और यह देखते हुए कि कौन सा छवि नाम नहीं मिला है। पूर्ण विश्लेषण के बाद, सॉफ़्टवेयर परिणामों को एक एक्सेल स्प्रेडशीट में व्यवस्थित करेगा जिसमें कॉलम एन में अलग-अलग कीड़े होते हैं, और कॉलम में समुच्चय की संबंधित संख्या K.सेलप्रोफ़ाइलर से आउटपुट सीएसवी फ़ाइल से डेटा को आसानी से व्यवस्थित करने के लिए मेटाडेटा आयोजक डाउनलोड करें।
विंडोज ओएस के लिए, डाउनलोड की गई फ़ाइल का पता लगाएं और इसे वांछित स्थान पर निकालें। gui_Windowsos_64x नाम के निकाले गए फ़ोल्डर की स्थिति जानें और खोलें। और जीयूआई एप्लिकेशन आइकन पर क्लिक करके एप्लिकेशन लॉन्च करें।
एक प्रॉम्प्ट चलाने की अनुमति का अनुरोध करते हुए खोल सकता है। अधिक जानकारी का चयन करें और फिर वैसे भी रन पर क्लिक करें। मेटाडेटा आयोजक अब सेलप्रोफाइलर आउटपुट सीएसवी फ़ाइलों को खींचने और छोड़ने के लिए तैयार है।
मैक ओएस के लिए, डाउनलोड की गई फ़ाइल की स्थिति जानें और फ़ाइल मेटाडेटा आयोजक एप्लिकेशन फ़ाइल निकालें। डाउनलोड में मिले निकाले गए फ़ोल्डर को खोलें। जीयूआई एप्लिकेशन पर राइट क्लिक करें और ओपन का चयन करें।
एक प्रॉम्प्ट आधिकारिक लाइसेंस की कमी के कारण खोलने की अनुमति मांगते हुए दिखाई देगा। खोलें का चयन करें। एक बार जब आपका मेटाडेटा आयोजक एप्लिकेशन संबंधित ओएस में खुला हो जाता है, तो अपनी फ़ाइलों को यहां अपलोड करने पर क्लिक करें, या वांछित सेलप्रोफाइलर सीएसवी फ़ाइलों को खींचें और छोड़ दें।
व्यवस्थित बटन पर क्लिक करें, जो उपयोगकर्ता को डाउनलोड फ़ाइल बटन के साथ एक नई स्क्रीन पर लाएगा। बटन पर क्लिक करें और आउटपुट फ़ाइल को सहेजने के लिए वांछित स्थान का चयन करें। आउटपुट फ़ाइल फ़ाइल नाम में जोड़े गए एक्सटेंशन _organized साथ मूल फ़ाइल नाम के रूप में दिखाई देगी।
एफयूडीआर की उपस्थिति में, विभिन्न बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े के शरीर का आकार अधिक सुसंगत था जो अधिक समान और सटीक कृमि का पता लगाने की अनुमति देता था, इस प्रकार भीड़भाड़ की समस्या को हल करता था। कीड़े को ठंडा करने से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को खत्म करके पॉलीक्यू कुल पहचान में सुधार हुआ, साथ ही मैनुअल गिनती की तुलना में स्वचालित गिनती की सटीकता भी। उल्टे ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग पूरे सी.एलिगेंस और जीएफपी चैनल को पॉलीक्यू वाईएफपी समुच्चय की छवि का पता लगाने के लिए किया गया था।
प्रत्येक कीड़े के लिए वर्म डिटेक्शन, अनटैंगलिंग और कुल मात्रा का ठहराव एक अनुकूलित सेलप्रोफाइलर इमेज प्रोसेसिंग पाइपलाइन को लागू करके किया गया था, जो प्रति व्यक्तिगत कृमि समुच्चय की संख्या प्राप्त करने की अनुमति देता है। स्वचालित कुल मात्रा का ठहराव की प्रभावकारिता और सेलप्रोफाइलर पाइपलाइन का उपयोग करके के बीच का अंतर न्यूनतम था, यह दर्शाता है कि स्वचालित विधि को बड़े पैमाने पर स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है। परीक्षण किए गए 90 जीवाणु उपभेदों में से, एक उम्मीदवार के साथ सी.एलिगेंस आंत के उपनिवेशीकरण ने समुच्चय की संख्या में महत्वपूर्ण कमी देखी।
मैनुअल गिनती द्वारा पुष्टि प्रयोगों से पता चला है कि म्यूटेंट में से कोई भी, जिसमें समुच्चय की संख्या में काफी कमी आई है, ने पॉलीक्यू एकत्रीकरण को प्रभावित किया। शोधकर्ता जो इस ढांचे का उपयोग करने का निर्णय लेते हैं, उन्हें समझना चाहिए कि उल्लिखित चरण पूर्ण नहीं हैं। संशोधन और सेलप्रोफ़ाइलर में हेरफेर करने के तरीके की मौलिक समझ सफलता के लिए आवश्यक है।
पॉलीक्यू एकत्रीकरण की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी सोख्ता जैसे अतिरिक्त जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।
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जीव विज्ञान अंक 176 सी एलिगेंस प्रोटियोस्टेसिस पॉलीग्लूटामाइन एकत्रीकरणRelated Videos
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