הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

במהלך השנים, Monolayers השומנים שימשו שכבה תומכת כדי לטפח את התגבשות 2D של חלבונים ממברנה היקפית, כמו גם חלבונים מסיסים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על התגבשות 2D, כמו כמה חלבונים ממברנה אינטגרלי. אבל דורש חקירה אמפירית נרחבת יותר כדי לקבוע תנאי דטרגנט ודיאליזה כדי לקדם חלוקה למונולייטר השומנים.

מונולייר שומנים נוצר בממשק מי האוויר, כך קבוצות הראש הקוטבי של השומנים להישאר hydrated בשלב מימי. וזנבות האציל הלא קוטביים של מחיצת השומנים לממשק מי האוויר, אשר שובר את מתח פני השטח ומשטח את פני המים. אופי המטען של moieties כימי ייחודי של קבוצות ראש השומנים לספק את הזיקה לחלבונים בתמיסה.

קידום כריכה, ובאופן עקרוני מערך 2D. כל גבישי 2D שנוצרו על monolayer שומנים ניתן להעביר בקלות לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים על רשת EM מצופה פחמן המשמש להרים ולתמוך במערך גבישי על שכבת השומנים. תיארנו בכתב היד הזה, מתודולוגיית חד-שכבתית שומנית להדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית.

הכנת חד-שכבתית שומנים. הכנת מלאי השומנים, להכין 0.01 מ”ג לתערובת שומנים מ”ל בנפח 9:1 כדי נפח כלורופורם, מתנול. שימוש 8.91 מ”ל של כלורופורם ו 0.99 מ”ל של מתנול ו 0.1 מיליליטר של 10 מ”ג לכל תמיסת שומנים מ”ל.

הכנת צלחת טפלון. סוניקאט צלחת טפלון באמבט מתנול במשך חמש דקות. לשטוף עם מים חמים במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים.

מייבשים את צלחת הטפלון במיובש במשך 30 דקות ושומרים אותה תחת ואקום עד לשימוש. היווצרות של חד שכבתית שומנים על מאגר חיץ. זמן הפעולה המשוער יהיה שעה וחצי.

מניחים נייר סינון מסוג אחד בצלחת פטרי ומסדרים את בלוק הטפלון על גבי נייר המסנן. מלאו את בארות צלחת הטפלון ב-60 מיקרוליטרים של חוצץ. מוסיפים בזהירות תערובת נוזלית על גבי משטח המאגר טיפה אחר טיפה.

באופן אידיאלי מיקרוליטר אחד לכל טיפה באמצעות מזרק המילטון. מרטיבים את נייר הסינון במים מזוקקים ושומרים על לחות בצלחת הפטרי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות, כלורופורם צריך להתאדות ו monolayer של שומנים על פני השטח של המאגרים צריך להיווצר.

יישום של רשת EM על monolayer שומנים. זמן פעולה משוער שעה וחצי. הניחו בעדינות רשת EM מצופה פחמן מבלי שזוהר משחרר את צד הפחמן כלפי מטה על פני השטח של כל מאגר חיץ.

בזהירות להזריק חלבונים לתוך הזרקת הצד היטב, להשתמש בריכוזים חלבון סופי בבאר סביב micromolar אחד. לדגור 60 דקות בטמפרטורת החדר. הזריקו בעדינות כ-20 עד 30 מיקרוליטרים של חוצץ ביציאת הזרקת האתר כדי להעלות את הרשת מעל פני השטח של בלוק הטפלון.

זה מאפשר לך להרים את הרשת עם זוג פינצטה ולהרים אותו אנכית את טיפה. תוצאות מייצגות. ניתן לדמיין מנמולר שומנים המופקד על רשת EM תחת מיקרוסקופ אלקטרונים השידור ללא כתמי ניגודיות.

ניתן לזהות את נוכחות השונאי, על ידי הבדל הניגודיות מהאזור ללא כל דגימה בנתיב הקרן. אזורים בעלי כיסוי חד-שכבתי עם שומנים יש ניגודיות נמוכה יותר מאשר אלה ללא כיסוי. מכיוון שלקרן האלקטרונים דרך החורים הריקים אין פיזור, היא מראה תאורה בהירה יותר.

לסיכום, שיטת monolayer השומנים מציעה הזדמנות ללמוד מבני חלבון בשל הפשטות שלה. זה עשוי לספק גישה חלופית כדי להקל על התהליך של התגבשות 2D.