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体外研究可生物降解种植体材料的直接和间接培养方法
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Summary April 15th, 2022
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我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估可生物降解植入物材料的 体外 细胞相容性。这些 体外 方法模仿不同的 体内 细胞 - 植入物相互作用，可以应用于研究各种可生物降解的材料。
Transcript
用于在体外研究可生物降解植入物材料的直接和间接培养方法。在过去的几十年中，可生物降解的材料已被广泛探索用于生物医学应用，例如骨科，牙科和颅颌面植入物。为了筛选用于生物医学应用的可生物降解材料，有必要从体外细胞反应，细胞相容性和细胞毒性的角度评估这些材料。
国际标准化组织的标准已被广泛用于生物材料的评估。然而，大多数ISO标准最初都是为了评估不可降解材料的样式毒性而建立的，因此为筛选可生物降解材料提供了有限的价值。在本视频中，我们将介绍和讨论三种不同的培养方法，即直接培养方法，直接暴露培养方法和用于评估可生物降解植入物材料的体外细胞相容性的暴露培养方法。
具体而言，直接培养方法评估新接种的细胞与植入物之间的相互作用。直接暴露培养模仿体内已建立的细胞与植入物之间的相互作用。暴露培养表征已建立的细胞和植入物之间的相互作用，当它们不是彼此直接接触而是在材料降解的相同环境中。
本视频提供了使用这三种培养方法研究可生物降解植入材料的体外细胞相容性及其与骨髓来源的间充质干细胞相互作用的示例。本视频中描述的体外方法模拟了体内环境的不同场景，拓宽了不同材料的体外细胞相容性测试对各种生物医学应用的适用性和相关性。我们遵循加州大学河滨分校机构动物护理和使用社区批准的用于细胞和组织收获的协议。
细胞培养制备。本视频中描述的三种培养方法通常适用于贴壁的不同细胞类型。在这里，将从大鼠断奶中收获的BMSC作为细胞培养制剂的一个例子介绍从大鼠断奶中收获骨髓来源的间充质干细胞。
该图中的示意图显示了从大鼠断奶中收获BMSC的步骤。取出皮肤和肌肉以及结缔组织，将股骨从安乐死的大鼠身上解剖出来。将股骨置于含有细胞培养基的15 mL锥形管中。
将锥形管放在冰上，直到进行细胞提取。将骨头转移到生物安全柜中的培养皿中。使用手术刀片切割骨头的末端，并使用带有25 1/2号针头的注射器用细胞培养基清洗骨髓腔，将骨髓冲洗到50 mL锥形管中。
使用70微米过滤器过滤细胞悬浮液，然后在126倍重力下离心5分钟，以使细胞沉淀吸出上清液培养基并补充10mL新鲜培养基。使用10 mL血清学移液器轻轻地上下移液以重悬细胞。将悬浮液直接移取在T-75烧瓶的内底部，并添加培养基以使体积达到25毫升。
在37摄氏度的标准无菌细胞培养环境中的培养箱中培养细胞，用5%的二氧化碳和95%的空气加湿的气氛培养细胞。三到七天后，通过吸附旧培养基并用新鲜培养基补充来冲洗掉非贴壁细胞。继续用新鲜培养基培养和喂养细胞，直到它们准备好进行细胞传代，冷冻或用于实验。
样品制备和灭菌。在细胞培养前对所有样品进行灭菌或消毒。不同样品类型的灭菌或消毒方法因材料的不同性质而异。
通常，使用紫外线辐射对可生物降解的金属进行消毒，以进行体外研究。细胞培养方法。此图中的示意图显示了直接培养方法的步骤。
在该视频中，将BMSC培养在放置在12孔组织培养处理板孔内的镁衍生板上培养，以说明培养方法为例。使用90%汇合烧瓶使用血细胞计数器测定细胞悬浮液中的细胞浓度。使用新鲜培养基将细胞悬浮液稀释至体外细胞研究所需的规定细胞浓度。
将样品置于12孔组织培养板的中心。依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中，以达到目的样品。
在标准细胞培养条件下在培养箱中培养细胞24小时。毁容中的示意图显示了直接暴露培养的步骤。根据不同细胞类型和预期应用的实验设计，用所需浓度的细胞制备细胞悬浮液。
依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中。在标准细胞培养条件下，在加湿的培养箱中培养细胞24小时或直到细胞达到50%至80%汇合。
冲洗24小时后，使用移液器用PBS将孔板中的细胞除去漂浮的死细胞。将消毒或灭菌的样品直接放在粘附的细胞上。将3 mL新鲜培养基加入每个孔中。
在标准细胞培养条件下再培养细胞24小时。此图中的示意图显示了暴露培养方法的步骤。细胞制备的初始步骤与直接暴露培养相同。
之后，将样品放入膜孔径为0.4微米的孔插入物中，并将带有样品的孔插入物与细胞一起放入每个孔中。在标准细胞培养条件下再培养细胞24小时。细胞的培养后表征。
对于直接培养和直接暴露培养，固定，染色，成像和分析孔板和样品上的细胞贴壁。对于暴露培养，分析粘附在孔板上的细胞。将每个孔中的培养后培养基收集到相应的15 mL锥形管中以进行进一步分析。
培养后收集所有样品以进行进一步分析。使用PBS冲洗样品和孔板上贴壁的细胞三次。将1 mL的4%多聚甲醛加入每个孔板中。
将盖子放回孔板上，让PFA反应20分钟。20分钟后，吸出PFA并将其分配到废瓶中。使用PBS冲洗孔板三次，以除去PFA并将废物转移到废物瓶中。
按照制造商的说明准备染色剂的工作库存。向每个孔中加入200至400微升稀释的Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂，以覆盖孔板和样品上的细胞。将孔板包裹在铝箔中以防止光线照射，并允许Alexa Fluor 488 Phalloidin在室温下反应20分钟。
收集Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂并将其分配到相应的废瓶中。使用PBS冲洗壁板三次，以去除多余的Alexa Fluor 488 Phalloidin，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。向每个孔中加入200至400微升稀释的DAPI，以覆盖孔中和样品上的细胞。
用铝箔包裹孔板，让DAPI在室温下反应五分钟。使用PBS冲洗孔板三次，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。染色后，使用荧光显微镜对细胞进行成像。
只要有可能，除了荧光图像外，还要拍摄细胞的相差图像。在可生物降解样品上尽快或染色后立即对细胞进行成像，以避免或减少样品连续降解引起的可能变化。对于直接培养和直接暴露培养，对两种类型的细胞进行成像和评估。
一，样品上的细胞与样品直接接触，二，细胞粘附在样品周围的孔板上，与样品直接接触，如图所示。对于曝光培养，如图所示，在拍摄细胞的荧光图像时使用图像指南来确定细胞对样品动态降解梯度的响应是否不同。对位于内环内区域（距中心3.5毫米）和外环（距中心7毫米）的细胞进行成像和分析。
对于每个样品，以及在培养板中，从每个感兴趣区域随机取至少五张图像，其中细胞在预定义的距离内间接接触或间接接触样品。从步骤4.3获得的所有细胞图像中，通过测量细胞扩散面积和纵横比来量化细胞形态，以进行图像分析。计算每个图像区域中的单元格数。
将直接和间接接触条件下的细胞粘附密度计算为每单位面积的细胞数。培养基和样品的培养后分析。在自我固定之前，收集后文化介质。
收集后立即使用预校准的pH计测量每个孔中培养后培养基的pH值。在pH测量的上一步之后，使用所需的稀释因子收集和稀释培养基，以最佳测量离子浓度。使用电感耦合等离子体 - 发射光谱仪测量培养基中目标离子的浓度，缩写为ICP-OES。
体外细胞研究后，可生物降解样品的尺寸、质量、表面形态、微观结构和组成可能会发生变化。样品的培养后分析有助于了解样品的降解机制。细胞培养后，拍摄样品的照片，以显示样品尺寸，颜色，形态和其他可见特征的可能变化。
干燥或脱水后培养样品，并测量样品质量、尺寸和体积，以量化质量、尺寸和体积的任何变化。使用扫描电子显微镜表征样品的微观结构和形态。使用能量色散X射线光谱和X射线去角力来表征样品上降解产物的组成和相。
使用 FTIR 或 ATR 检测样品表面上的化学键合。具有代表性的结果。在这里，该图显示了使用不同培养方法在直接和间接接触条件下骨髓来源的干细胞的代表性荧光图像。
此图显示了量化细胞粘附密度的示例数据。如图A所示，在24小时直接暴露培养中，与ZC21直接接触的BMSC具有明显高于任何其他组的细胞粘附密度。如图B所示，在直接接触培养物的间接接触条件下，ZC21组的BMSC粘附密度明显高于镁基团。
然而，与T64和仅细胞对照组相比，它没有显着差异。图A显示了直接暴露培养和直接培养后培养基的pH值。对于直接暴露培养物，所有样品的培养基pH值范围为8.3至8.4。
在直接培养物中，各组培养基的pH值范围为7.9至8。图B显示了后培养基中的镁离子浓度。在直接暴露培养和直接培养中，ZC21和镁基团中的镁离子浓度显着高于任何其他对照组。
该图显示了ZSr41和纯镁在三天暴露培养后的XRD模式。观察到不同组合物的结晶相，如镁，氧化锌和羟基磷灰石。图A显示了氧化镁包被镁的表面元素组成的SEM图像和EDX图的叠加，以及BMSC直接培养24小时后镁基底和玻璃的控制。
图B显示了样品表面的定量表面元素组成，表明在细胞培养过程中形成的不同沉积。结论。在本视频中，我们介绍了三种不同的体外方法，用于根据不同的实验设计和预期应用评估可生物降解植入物材料的细胞相容性。通过直接培养法、直接暴露培养法和暴露培养法，可以研究材料与各种类型细胞之间的相互作用。
该视频介绍了关键的体外方法，以研究可生物降解材料及其降解产物对各种医疗植入物应用的细胞行为的影响。
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