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Métodos de cultivo directo e indirecto para el estudio de materiales de implantes biodegradables in vitro

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Métodos de cultivo directo e indirecto para el estudio de materiales de implantes biodegradables in vitro

Article DOI: 10.3791/63065-v • 14:49 min

April 15th, 2022 •

Changlu Xu*¹, Yiqing Chen*¹, Jiajia Lin¹, Huinan H. Liu^1,2,3

¹Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, ²Department of Bioengineering, University of California, Riverside, ³Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

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April 15th, 2022

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Introducimos tres métodos de cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables. Estos métodos in vitro imitan diferentes interacciones célula-implante in vivo y se pueden aplicar para estudiar diversos materiales biodegradables.

Transcript

Métodos de cultivo directo e indirecto para el estudio de materiales de implantes biodegradables in vitro. En las últimas décadas, los materiales biodegradables se han explorado ampliamente para aplicaciones biomédicas, como implantes maxilofaciales ortopédicos, dentales y craneales. para examinar los materiales biodegradables para aplicaciones biomédicas, es necesario evaluar estos materiales en términos de respuestas celulares in vitro, citocompatibilidad y citotoxicidad.

Las normas de la Organización Internacional de Normalización se han utilizado ampliamente en las evaluaciones de biomateriales. Sin embargo, la mayoría de las normas ISO se establecieron originalmente para evaluar la toxicidad de estilo de los materiales no degradables, proporcionando así un valor limitado para el cribado de materiales biodegradables. En este video, presentaremos y discutiremos tres métodos de cultivo diferentes, a saber, el método de cultivo directo, el método de cultivo de exposición directa y el método de cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables.

Específicamente, el método de cultivo directo evalúa las interacciones entre las células recién sembradas y los implantes. El cultivo de exposición directa imita las interacciones entre las células establecidas en el cuerpo y los implantes. El cultivo de exposición caracteriza las interacciones entre las células establecidas y los implantes cuando no están en contacto directo entre sí, sino en el mismo entorno donde los materiales se degradan.

Este video proporciona ejemplos del uso de estos tres métodos de cultivo para estudiar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables y sus interacciones con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. Los métodos in vitro descritos en este video imitan diferentes escenarios del entorno in vivo, ampliando la aplicabilidad y relevancia de las pruebas de citocompatibilidad in vitro de diferentes materiales para diversas aplicaciones biomédicas. Seguimos un protocolo aprobado por la Comunidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en Riverside para la recolección de células y tejidos.

Preparación de cultivos celulares. Los tres métodos de cultivo descritos en este video son generalmente aplicables para diferentes tipos de células que son adherentes. Aquí, las BMSC cosechadas de destetes de ratas se introducirán como un ejemplo para la preparación del cultivo celular Cosecha de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea de destetes de ratas.

El diagrama esquemático de esta figura muestra los pasos para cosechar BMSCs de destetes de ratas. Retire la piel, los músculos y los tejidos conectivos para diseccionar el fémur de la rata sacrificada. Coloque los huesos femorales en un tubo cónico de 15 ml que contenga medios de cultivo celular.

Coloque los tubos cónicos sobre hielo hasta el momento de realizar la extracción celular. Transfiera los huesos a una placa de Petri en el gabinete de seguridad biológica. Corte los extremos del hueso con una cuchilla quirúrgica y enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 50 ml lavando la cavidad de la médula ósea con medios de cultivo celular con una jeringa con la aguja de calibre 25 1/2.

Filtre la suspensión de la celda utilizando un filtro de 70 micrómetros seguido de centrifugación a 126 veces la gravedad durante cinco minutos para obtener los gránulos de la celda Aspire los medios sobrenadantes y reponga con 10 ml de medios frescos. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspendir las células usando una pipeta serológica de 10 ml. Pipetee la suspensión directamente en la parte inferior interior de un matraz T-75 y agregue medios para llevar el volumen hasta 25 mililitros.

Cultive las células en una incubadora en un entorno de cultivo celular estéril estándar que es de 37 grados centígrados, atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. Después de tres a siete días, enjuague las células no adherentes aspirando a los medios viejos y reabasteciéndolos con medios frescos. Continúe cultivando y alimentando las células con medios frescos hasta que estén listas para el paso celular, la congelación o el uso en un experimento.

Preparación y esterilización de muestras. Esterilizar o desinfectar todas las muestras antes del cultivo celular. Los métodos de esterilización o desinfección para diferentes tipos de muestras varían según las diferentes propiedades de los materiales.

En general, utilizar la radiación ultravioleta para desinfectar metales biodegradables para estudios in vitro. Métodos de cultivo celular. El diagrama esquemático de esta figura muestra los pasos del método de referencia cultural directa.

En este video, los BMSC se cultivaron en una placa derivada del magnesio colocada dentro de los pocillos de una placa tratada con cultivo de tejidos de 12 pocillos como ejemplo para ilustrar el método de cultivo. Utilice un matraz confluente al 90% para determinar la concentración celular en la suspensión celular utilizando un hemocitómetro. Diluir la suspensión celular utilizando medios frescos a una concentración celular prescrita necesaria para el estudio celular in vitro.

Coloque las muestras en el centro de las placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Enjuague las placas de cultivo con 2 ml de PBS y 2 ml de DMEM secuencialmente para calibrar la presión osmótica en condiciones estériles. Agregue 3 ml de la suspensión celular diluida en cada pozo sobre las muestras de interés.

Cultive las células en una incubadora en condiciones estándar de cultivo celular durante 24 horas. El diagrama esquemático en desfiguración muestra los pasos de la cultura de exposición directa. Preparar la suspensión celular con las concentraciones requeridas de células basadas en el diseño experimental para diferentes tipos de células y aplicaciones previstas.

Enjuague las placas de cultivo con 2 ml de PBS y 2 ml de DMEM secuencialmente para calibrar la presión osmótica en condiciones estériles. Agregue 3 ml de la suspensión celular diluida en cada pocillo. Cultive las células en la incubadora humidificada en condiciones estándar de cultivo celular durante 24 horas o hasta que las células alcancen entre el 50% y el 80% de confluencia.

Después de 24 horas de enjuague, las células en la placa del pozo con PBS usando una pipeta para eliminar las células muertas flotantes. Coloque las muestras desinfectadas o esterilizadas directamente sobre las células adheridas. Agregue 3 ml de medios frescos en cada pozo.

Cultive las células en condiciones estándar de cultivo celular durante otras 24 horas. El diagrama esquemático de esta figura muestra los pasos del método de cultivo de exposición. Los pasos iniciales para la preparación celular son los mismos que el cultivo de exposición directa.

Luego, coloque las muestras en los insertos de pozo con un tamaño de poro de membrana de 0,4 micrómetros y coloque los insertos de pozo con las muestras en cada pozo con las células. Cultive las células en condiciones estándar de cultivo celular durante otras 24 horas. Caracterización postcultiva de células.

Para el cultivo directo y el cultivo de exposición directa, fije, manche, visualice y analice las células adherentes tanto en las placas de pozos como en las muestras. Para el cultivo de exposición, analice las células adheridas a las placas del pozo. Recoja los medios de postcultivo de cada pozo en un tubo cónico correspondiente de 15 ml para su posterior análisis.

Recoger todas las muestras después del cultivo para su posterior análisis. Enjuague las células adheridas tanto en muestras como en placas de pozos tres veces usando PBS. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% en cada placa de pozo.

Vuelva a colocar la tapa en la placa del pozo y permita que el PFA reaccione durante 20 minutos. Después de 20 minutos, aspire el PFA y dispensarlo en una botella de desecho. Enjuague la placa del pozo tres veces usando PBS para eliminar el PFA y transferir los desechos a la botella de desechos.

Prepare las existencias de trabajo de los agentes de tinción siguiendo las instrucciones del fabricante. Agregue de 200 a 400 microlitros de agente de tinción de faloidina Alexa Fluor 488 diluido a cada pocillo para cubrir las células en la placa del pozo y la muestra. Envuelva la placa del pozo en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y permita que la alexa Fluor 488 faloidina reaccione durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Recoge el agente de tinción Alexa Fluor 488 Faloidina y dispensalo en la botella de residuos correspondiente. Enjuague las placas de pared tres veces usando PBS para eliminar el exceso de Alexa Fluor 488 Phalloidin y dispense el PBS usado en la botella de desecho correspondiente. Agregue de 200 a 400 microlitros de DAPI diluido a cada pozo para cubrir las células en el pozo y en la muestra.

Envuelva la placa del pozo en papel de aluminio y permita que el DAPI reaccione durante cinco minutos a temperatura ambiente. Enjuague la placa del pozo tres veces con PBS y dispense el PBS usado en la botella de desecho correspondiente. Después de la tinción, tome imágenes de las células con un microscopio de fluorescencia.

Siempre que sea posible, tome imágenes de contraste de fase de las células además de imágenes de fluorescencia. Tome imágenes de las células en las muestras biodegradables tan pronto como sea posible o inmediatamente después de la tinción para evitar o reducir los posibles cambios causados por la degradación continua de las muestras. Para el cultivo directo y el cultivo de exposición directa, imagen y evaluación de dos tipos de células.

Uno, las células de las muestras en contacto directo con las muestras, y dos, las células adheridas en la placa del pozo que rodea las muestras en contacto directo con las muestras como se muestra en la figura. Para el cultivo de exposición, como se muestra aquí, use la guía de imágenes al tomar las imágenes de fluorescencia de las células para determinar si la respuesta de la célula sería diferente en respuesta al gradiente de degradación dinámica de las muestras. Imagen y análisis de células ubicadas en el área dentro del anillo interior, a 3,5 mm del centro, y el anillo exterior, que está a 7 mm del centro por separado.

Para cada muestra, y mientras esté en las placas de cultivo, tome aleatoriamente al menos cinco imágenes de cada área de interés donde las células estén en contacto indirecto o en contacto indirecto con las muestras a una distancia predefinida. A partir de todas las imágenes celulares obtenidas del paso 4.3, cuantifique la morfología celular midiendo el área de propagación celular y la relación de aspecto para el análisis de imágenes. Cuente el número de celdas en cada área de la imagen.

Calcule la densidad de adhesión celular en condiciones de contacto directo e indirecto como el número de células por unidad de área. Análisis postcultivo de medios y muestras. Antes de la autofijación, recoge los medios de postcultura.

Mida los valores de pH de los medios de postcultivo en cada pozo inmediatamente después de la recolección utilizando un medidor de pH precalibrado. Siguiendo el paso anterior de medición de pH, recolecte y diluya el medio utilizando un factor de dilución deseable para mediciones óptimas de las concentraciones de iones. Mida las concentraciones de los iones de interés en los medios de postcultivo utilizando un espectrómetro de emisión plasma-óptica acoplado inductivamente abreviado como ICP-OES.

Después del estudio celular in vitro, las muestras biodegradables pueden cambiar en dimensión, masa, morfología de la superficie, microestructura y composición. El análisis posterior al cultivo de muestras ayuda a comprender el mecanismo de degradación de las muestras. Después del cultivo celular, tome las fotografías de las muestras para mostrar posibles cambios en la dimensión de la muestra, el color, la morfología y otras características visibles.

Secar o deshidratar las muestras posteriores al cultivo y medir la masa, dimensión y volumen de la muestra para cuantificar cualquier cambio en la masa, dimensión y volumen. Utilice un microscopio electrónico de barrido para caracterizar la microestructura y la morfología de las muestras. Utilice la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía y la defracción de rayos X para caracterizar la composición y la fase de los productos de degradación en las muestras.

Utilice FTIR o ATR para detectar el enlace químico en las superficies de la muestra. Resultados representativos. Aquí, la figura muestra las imágenes representativas de fluorescencia de células madre derivadas de la médula ósea en condiciones de contacto directo e indirecto utilizando diferentes métodos de cultivo.

Esta figura muestra los datos de ejemplo para la densidad de adhesión celular cuantificada. Como se muestra en la figura A, en el cultivo de exposición directa de 24 horas, las BMSC en contacto directo con la ZC21 tienen una densidad de adhesión celular significativamente mayor que cualquier otro grupo. Como se muestra en la figura B, en la condición de contacto indirecto del cultivo de exposición directa, la densidad de adhesión BMSC es significativamente mayor para el grupo ZC21 que para el grupo magnesio.

Sin embargo, no muestra diferencias significativas en comparación con los grupos de control T64 y solo células. Aquí, la figura A muestra el valor de pH de los medios de postcultura después de la cultura de exposición directa y la cultura directa. Para el cultivo de exposición directa, los valores de pH de los medios oscilan entre 8,3 y 8,4 para todas las muestras.

En el cultivo directo, los valores de pH de los medios varían de 7,9 a 8 en todos los grupos. La Figura B muestra la concentración de iones de magnesio en los medios de postcultivo. Tanto en el cultivo de exposición directa como en el cultivo directo, sus concentraciones de iones de magnesio en los grupos ZC21 y magnesio son significativamente más altas que en cualquier otro grupo de control.

Esta figura muestra los patrones XRD para ZSr41 y magnesio puro después de un cultivo de exposición de tres días. Se observaron las fases cristalinas de diferentes composiciones, como magnesio, óxido de zinc e hidroxiapatita. Aquí, la figura A muestra la superposición de imágenes SEM y mapas EDX de la composición elemental de la superficie para el magnesio recubierto de óxido de magnesio, y el control de los sustratos de magnesio y el vidrio después de 24 horas de cultivo directo con BMSC.

La Figura B muestra la composición elemental de la superficie cuantitativa de las superficies de la muestra, indicando diferentes deposiciones formadas durante el cultivo celular. Conclusiones. En este video, presentamos tres métodos in vitro diferentes para evaluar la citocompatibilidad de materiales de implantes biodegradables basados en diferentes diseños experimentales y aplicaciones previstas. Las interacciones entre los materiales y varios tipos de células podrían investigarse a través del método de cultivo directo, el método de cultivo de exposición directa y el método de cultivo de exposición.

Este video ha presentado métodos clave in vitro para estudiar el efecto de los materiales biodegradables junto con sus productos de degradación en los comportamientos celulares para una variedad de aplicaciones de implantes médicos.

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